【摘要】：肝臟是人體重要的器官，主要承擔機體代謝、去氧化、糖原儲存、白蛋白分泌以及膽汁分泌等功能，在毒物藥物代謝中發(fā)揮重要作用。由各種原因引發(fā)的終末期肝病是危害人類健康的重大疾病[1]，我國作為肝病大國，這種現(xiàn)象尤為嚴重。目前針對終末期肝病的唯一有效的治療方式是肝移植，但是供體短缺、移植后免疫抑制劑的長期應用所致的經(jīng)濟負擔、生活質(zhì)量下降和可能的并發(fā)癥，以及移植手術(shù)本身存在的風險都在一定程度上限制了它的應用[2]。隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展與成熟，細胞治療已成為終末期肝病治療的一個新選擇[3]。而安全、充足、臨床獲取方便的種子細胞來源是需要解決的首要問題。目前已經(jīng)嘗試用于臨床治療的種子細胞包括胎兒或尸體來源的肝細胞和間充質(zhì)干細胞，但是，這些細胞分別存在來源、倫理、分化效率、功能維持、作用機理或免疫排斥等問題，并非臨床應用的理想細胞來源[4]。 胚胎干細胞（embryonic stem cell, ESC）是具有自我更新和分化全能性的細胞，理論上可以分化形成機體所有類型的細胞，因此在重大疾病細胞治療、藥物篩選、疾病模型建立等方面具有巨大的應用潛能。但是由于來源于胚胎發(fā)育囊胚期內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM），由此而帶來的倫理爭議大大地阻礙了ESC的應用。此外，ESC在疾病治療中存在的免疫排斥問題以及形成畸胎瘤的風險同樣制約著ESC的應用。 誘導多能性干細胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）是通過體細胞重編程技術(shù)從成體細胞獲得的類似于ESC的多能性干細胞。iPSC不但具有和ESC一樣的分化潛能，而且由于來源于病人自體的體細胞，在克服ESC應用的倫理爭議問題的同時，更有利于實現(xiàn)對病人或者疾病的個體化治療。然而，即使目前眾多研究已經(jīng)通過經(jīng)典的重編程方法從幾乎所有的體細胞獲得了iPSC[5][6]，并證實iPSC可向功能性的肝[7]、心肌[8]和血液[9]等功能性細胞誘導分化，但仍舊無法規(guī)避其在應用中重編程效率和誘導分化效率較低，以及成瘤性的風險。 近年來，越來越多的研究證實通過譜系重編程的方式，可以將終末分化的細胞進行直接轉(zhuǎn)分化，或者去分化成為其祖細胞，通過這種方式不但可以為臨床應用提供足夠的種子細胞，而且也避免了重編程路徑長、誘導分化譜系雜和成瘤性的風險，從而可以為重大性疾病細胞治療的臨床應用尋找更為理想可控的種子細胞。因此，我們針對起始細胞選擇、重編程策略優(yōu)化、小分子化合物引入、重編程目的細胞鑒定等問題進行了系統(tǒng)研究。本論文主要分為兩大部分，在第一部分中，我們利用經(jīng)典的體細胞重編程方式從人包皮成纖維（human foreskin fibroblast,HFF）細胞誘導獲得了iPSC，并證實其在體外具有多向分化潛能；在第二部分中，我們通過篩選較為原始、并且與肝臟具有發(fā)育相關(guān)性的消化道上皮干/祖細胞作為重編程的起始細胞，實現(xiàn)通過非病毒載體的理化方式獲得誘導內(nèi)胚層多能干細胞（inducedendodermal mutipotent stem cell,iEMSC），再將iEMSC定向誘導分化，獲得功能性肝細胞，進而為包括終末期肝病在內(nèi)的重大性疾病的細胞治療提供理想的種子細胞來源。 一、利用多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子將體細胞重編程為誘導多能干細胞（iPSC） 自2006年日本京都大學Yamanaka實驗室通過向MEF中導入ESC全能性特異的轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2獲得了iPSC開始[6]，目前已經(jīng)有眾多研究通過相似的方法從幾乎所有類型的成體終末分化的細胞重編程獲得iPSC，，并且也可以將iPSC誘導分化獲得功能性的成熟細胞。iPSC的出現(xiàn)，不但為終末期肝病等重大疾病的細胞治療提供了患者和疾病特異性的種子細胞，同樣也為干細胞與再生醫(yī)學的機制研究提供了理想的體外研究模型。所以在本部分研究中，我們利用Yamanaka實驗室的誘導重編程體系建立了本實驗室的iPSC，通過對其造血和成牙分化能力的檢測，證實其具有多向誘導分化潛能。以此建立本實驗室體細胞重編程機制和臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學的研究平臺。 首先我們構(gòu)建了表達Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2的重組腺病毒載體，并與Yamanaka實驗室的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別感染HFF細胞。通過25天的誘導，可以獲得呈克隆樣生長，AP染色陽性的細胞。將這些細胞在體外進行傳代擴增并進行驗證，免疫熒光的結(jié)果顯示這些細胞表達ESC的全能性標志Oct4、Nanog和SSEA-3；通過RT-PCR對內(nèi)源性和外源性基因的檢測結(jié)果證實這些細胞內(nèi)表達內(nèi)源性的多能性基因，而外源性多能性基因被很好的沉默，初步證實了獲得的細胞是iPSC。 為了驗證iPSC的體外分化能力，我們將獲得的iPSC和ESC分別與OP9共培養(yǎng)進行造血誘導分化，并驗證Wnt3a在此過程中的作用。通過對各個階段的標志的流式檢測結(jié)果顯示，在誘導分化第3.75天時，不管是iPSC還是ESC組，與Wnt3a-OP9共培養(yǎng)的實驗組Flk-1~+細胞的比例都較OP9共培養(yǎng)組有明顯的上升，其中iPSC-Wnt3a-OP9組為59.06%，iPSC-OP9組比例為47.11%；ESC-Wnt3a-OP9中為31.91%，明顯高于ESC-OP9的22.88%。在共培養(yǎng)第5天時，同樣在miPSC和mESC-EBs兩種細胞的共培養(yǎng)體系中，實驗組CD41~+細胞的比例較OP9共培養(yǎng)組也都有明顯的上升。通過我們的研究，我們首先證實iPSC在體外具有和ESC相同的造血誘導分化能力，同時也證實在ESC和iPSC造血誘導分化早期，Wnt3a可以明顯提高兩者的造血誘導分化效率。 同時，通過將iPSC來源的EBs和分離培養(yǎng)的小鼠牙胚間質(zhì)細胞共培養(yǎng)并移植于小鼠腎包囊4周后可以觀察到牙芽的形成，RT-PCR結(jié)果顯示牙源性上皮細胞Msx1、Lhx7、Pax9和Runx2的表達，說明iPSC具有向牙源性上皮細胞誘導分化的能力。從而證實了iPSC的多向誘導分化能力，為日后iPSC向功能性肝細胞誘導分化獲得患者特異性的種子細胞提供了良好的技術(shù)平臺。二、利用小分子化合物將上皮細胞譜系重編程獲得誘導內(nèi)胚層多能干細胞（iEMSC） 雖然iPSC保留了ESC的優(yōu)勢并避免了ESC應用的倫理爭議和免疫排斥問題，但是iPSC在應用中依然存在著重編程路徑長、誘導分化譜系雜和成瘤性的風險。此外，大量的外源性基因改造導致的iPSC染色體異常、重編程過程中病毒載體的使用以及低效率等問題都是iPSC在應用前有待解決的問題。近兩年，譜系重編程由于具有重編程路徑相對短、誘導分化譜系局限性和不具有形成畸胎瘤風險的優(yōu)勢，為解決iPSC應用中存在問題提供了可行的突破方案。并且，通過選擇合適的起始細胞，完全可以實現(xiàn)用更少的轉(zhuǎn)錄因子或者不需要轉(zhuǎn)錄因子和非病毒載體介導的策略實現(xiàn)體細胞重編程。在本部分研究中，我們選擇患者來源的消化道上皮干/祖細胞作為起始細胞，通過較為安全的非病毒載體理化方式，將其重編程為分化能力低于ESC和iPSC的iEMSC。通過對iEMSC的鑒定，證實其為類似于定型內(nèi)胚層（Definitive endoderm，DE）的內(nèi)胚層多能干細胞。 首先，我們對獲得的消化道組織進行了組織原位鑒定，發(fā)現(xiàn)在胃竇、十二指腸粘膜、結(jié)腸隱窩等部位存在著表達CK19、CXCR4、EpCAM、Sox9、Lgr5的上皮干/祖細胞。通過實驗室建立的原代上皮細胞分離方法，發(fā)現(xiàn)獲得的上皮干/祖細胞具有一定分化能力，但是體外的增殖能力非常有限的。根據(jù)丁盛等人的研究，我們對譜系重編程的最佳小分子組合進行篩選，并通過最適的小分子組合將消化道上皮干/祖細胞譜系重編程獲得iEMSC。 對iEMSC進行增殖能力、表型、基因型和核型的鑒定，結(jié)果顯示iEMSC呈克隆樣生長，具有良好的體外增殖能力；與ESC來源的DE具有相似的細胞形態(tài)，并且表達DE的特異性標志Sox17、FoxA2；實時定量PCR結(jié)果顯示iEMSC的基因表達譜與DE相似，而完全不同于重編程前的消化道上皮干/祖細胞；對Sox17的啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)進行檢測，發(fā)現(xiàn)較起始細胞發(fā)生了很大程度的去甲基化；體外分化結(jié)果顯示，獲得的iEMSC可以分化成為肝細胞、胰島細胞、腸道細胞和膽管細胞。并對獲得的肝細胞進行體外特異性功能驗證，結(jié)果顯示i-Hep具有正常肝細胞所具有的生物學功能。 綜上所述，我們的研究表明：由于體細胞重編程中表觀記憶的存在，起始細胞狀態(tài)與重編程策略直接相關(guān)。通過選擇分化程度低、同源性高的干/祖細胞作為起始細胞，可以實現(xiàn)不依賴外源性轉(zhuǎn)錄因子、安全可控的理化方式的體細胞重編程，進而為包括終末期肝病的重大性疾病的治療提供新的、安全可控的種子細胞來源。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2460282