發(fā)布時(shí)間：2019-04-17 17:41

【摘要】：研究背景及目的： 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β是一類普遍存在的細(xì)胞因子,在缺血性腦損傷中,TGF-β已被證實(shí)有神經(jīng)保護(hù)作用。Smad家族是TGF-β受體的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,不同Smad蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著不同的作用。Smad2作為TGF-β信號(hào)通路的始動(dòng)效應(yīng)分子,其在缺血性腦血管病中的作用機(jī)制尚不完全明了 鈣離子是體內(nèi)重要的信號(hào)分子,病理情況下如氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣超載可以直接激活Caspase或其他激酶誘發(fā)凋亡。既往認(rèn)為高爾基體在鈣離子調(diào)節(jié)上作用較小,然而最新的研究結(jié)果表明,高爾基體同樣在維持胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)中有著重要作用。分泌途徑衍生鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶(Secretory-pathway Ca2+-ATPase, SPCA)是P型ATP酶(P-type ATPases)的一類亞家族,目前已知SPCA的編碼基因至少有兩種：ATP2C1和ATP2C2,分別編碼SPCA1和SPCA2,都定位于高爾基體且SPCA1表現(xiàn)出的活性更強(qiáng)。SPCA1泵控制著高爾基體內(nèi)鈣離子濃度,對(duì)高爾基體內(nèi)及胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化有著重要意義。SPCA1在腦組織中高表達(dá)并伴隨著高活性。SPCA1在神經(jīng)元的發(fā)育、遷移、形態(tài)發(fā)生中起著重要作用；神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中SPCA1持續(xù)性高表達(dá)的區(qū)域如海馬、皮質(zhì)、小腦恰好是對(duì)缺血最敏感的部位,以上均提示SPCA1在維持高爾基體功能和在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的重要性。目前SPCA1的研究多局限在皮膚病,關(guān)于其在腦缺血性疾病中的作用研究很少。TGF-p可以通過下調(diào)胞內(nèi)鈣離子濃度達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用,Smad2對(duì)于SPCA1的表達(dá)及功能是否有影響,國(guó)內(nèi)外尚無研究。 死亡相關(guān)蛋白激酶(Death-as-sociating protein kinase, DAPK1)是一類鈣離子／鈣調(diào)素依賴激酶,目前認(rèn)為DAPK1的主要生物學(xué)作用是參與細(xì)胞凋亡過程,在各種不同刺激下?lián)蔚蛲稣蛘{(diào)節(jié)者的作用。 DAPK1與神經(jīng)細(xì)胞的死亡密切相關(guān),有研究表明低氧-缺血損傷動(dòng)物模型中其活性升高,而DAPK1的抑制劑可以減輕缺血性腦損傷帶來的打擊,因此關(guān)于DAPK1在腦缺血再灌損傷中的作用正在成為目前的研究熱點(diǎn)和藥物靶點(diǎn),但是國(guó)內(nèi)的系統(tǒng)研究尚較少。Jang等發(fā)現(xiàn)TGF-β通過Smad2-4激活DAPK1的啟動(dòng)子而誘導(dǎo)其表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。但是這一途徑在神經(jīng)細(xì)胞中是否立還未經(jīng)證實(shí)。 本研究的目的旨在探索Smad2蛋白在腦缺血再灌損傷中的作用,是否與調(diào)節(jié)高爾基體鈣泵SPCA1的功能和DAPK1相關(guān),探討Smad2可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。 研究方法： 1.培養(yǎng)小鼠神經(jīng)細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞,建立氧糖剝奪再灌注模型,并采用MTT法、酶學(xué)檢查、光學(xué)顯微鏡評(píng)價(jià)氧糖剝奪模型； 2.實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、普通OGD/R組、藥物干預(yù)后OGD/R組,其中普通OGD/R組、藥物干預(yù)后OGD/R組按時(shí)間點(diǎn)不同分為1h、4h、6h三個(gè)亞組。干預(yù)藥物為Smad2磷酸化抑制劑SB431542,特異性阻斷Smad2活化。 3.流式細(xì)胞儀測(cè)定各組中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化以及凋亡率的變化。 4. Western blot檢測(cè)各組中Smad2, p Smad2, SPCA1, DAPK1的蛋白表達(dá)變化。 5. QRT-PCR檢測(cè)Smad2, SPCA1,DAPK1的基因表達(dá)水平變化。 6.酶學(xué)法測(cè)定各組中SPCA1活性的變化。 7.免疫熒光共聚焦方法觀察SPCA1的細(xì)胞亞定位。 結(jié)果： 1.氧糖剝奪后細(xì)胞形態(tài)變化、LDH釋放量、MTT檢測(cè)顯示：隨著氧糖剝奪時(shí)間延長(zhǎng),小鼠N2a細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化,MTT吸光度值逐漸降低,培養(yǎng)液中LDH釋放逐漸增加；氧糖剝奪／再灌注組均較同時(shí)間點(diǎn)氧糖剝奪組細(xì)胞形態(tài)變化明顯,LDH釋放量更大,MTT吸光度值更低(P0.05),表明再灌注過程進(jìn)一步降低了細(xì)胞活性,加重了細(xì)胞損傷； 2.細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化：在經(jīng)歷氧糖剝奪／再灌注后,各組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度均較正常組明顯升高(P0.05),說明OGD/R誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)鈣超載。鈣超載的程度與OGD持續(xù)時(shí)間相關(guān),4h時(shí)間點(diǎn)的鈣離子濃度值為各時(shí)間點(diǎn)亞組中的最高值(P0.01)。相同氧糖剝奪/再灌注時(shí)間點(diǎn),藥物干預(yù)組的鈣超載效應(yīng)更明顯(P0.05)。 3. SPCA1活性的變化：在氧糖剝奪再灌注后,細(xì)胞SPCA1的酶活性較正常組顯著下降(P0.05),且下降程度與OGD持續(xù)時(shí)間相關(guān)。相同OGD時(shí)間點(diǎn)下,藥物干預(yù)后的OGD/R組酶活性較未干預(yù)組更低(P0.05)。在普通OGD/R組,三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間OGD6h/R組的酶活性最低(P0.05)；在藥物干預(yù)后的OGD/R組,酶活性最低值出現(xiàn)在OGD4h/R組(P0.05)。經(jīng)相關(guān)分析表明,鈣離子濃度的變化與SPCA1酶活性的變化呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.722,P0.01)。 4.免疫熒光共聚焦結(jié)果：標(biāo)記SPCA1的紅色免疫熒光與標(biāo)記GM130的綠色免疫熒光發(fā)生了明顯重疊。說明SPCA1定位于高爾基體。 5. Smad2的蛋白和基因表達(dá)變化：經(jīng)歷OGD/R之后,各組的Smad2的蛋白和基因表達(dá)水平均高于正常組,且與OGD的持續(xù)時(shí)間相關(guān),說明氧糖剝奪再灌注能上調(diào)Smad2的表達(dá)。在普通OGD/R組中,4h時(shí)間點(diǎn)Smad2的蛋白和基因表達(dá)水平為峰值(P0.05)；磷酸化pSmad2的表達(dá)趨勢(shì)與Smad2一致。在藥物干預(yù)后,各時(shí)間點(diǎn)的Smad2蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯下降(P0.05),表明藥物成功抑制了磷酸化pSmad2的表達(dá),從而使總Smad2的蛋白水平下降；同時(shí)在基因水平也出現(xiàn)了有趣的變化,1h時(shí)間點(diǎn)Smad2的表達(dá)水平要高于普通OGD/R組,而4h及6h時(shí)間點(diǎn)Smad2的表達(dá)水平卻低于普通OGD/R組,6h時(shí)間點(diǎn)的蛋白和基因表達(dá)水平為最低值(P0.05)。 6. SPCA1的蛋白和基因表達(dá)變化：氧糖剝奪再灌注之后,SPCA1的蛋白和mRNA水平較正常組明顯下降(P0.05),與OGD持續(xù)時(shí)間呈相關(guān)性。在普通OGD/R組,1h和4h時(shí)間點(diǎn)的SPCA1蛋白呈持續(xù)低表達(dá)水平,6h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)(P0.05)；藥物干預(yù)后的OGD/R組也出現(xiàn)了同樣的趨勢(shì)(P0.01)。mRNA的變化趨勢(shì)與蛋白水平一致。我們進(jìn)一步比較了同時(shí)間點(diǎn)下抑制Smad2的活性對(duì)于SPCA1表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn),只有在6h時(shí)間點(diǎn),兩組出現(xiàn)了表達(dá)差異,藥物干預(yù)組的SPCA1蛋白和基因表達(dá)水平較普通OGD/R組升高(P0.05)。 7. DAPK1的蛋白和基因表達(dá)變化：氧糖剝奪再灌注之后,DAPK1的蛋白和基因表達(dá)水平較正常組上調(diào)(P0.05)；且與氧糖剝奪的持續(xù)時(shí)間相關(guān)。4h時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平最高(P0.05)。藥物阻斷Smad2活化使DAPK1的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P0.05)。 8.細(xì)胞凋亡率的變化：氧糖剝奪再灌注過程誘發(fā)了細(xì)胞的凋亡,與正常對(duì)照組有明顯差異(P0.05)；凋亡率與OGD的持續(xù)時(shí)間相關(guān),4h組的凋亡率最高(P0.01)。藥物干預(yù)使凋亡率較同時(shí)間點(diǎn)普通OGD/R組明顯上升(P0.05),說明阻斷Smad2的活化加重了細(xì)胞的凋亡損傷。 結(jié)論： 1. Smad2的表達(dá)水平受氧糖剝奪再灌注的調(diào)節(jié)。阻斷Smad2的活化加重了細(xì)胞內(nèi)鈣超載的程度和凋亡率；Smad2有神經(jīng)保護(hù)作用。 2.氧糖剝奪再灌注抑制SPCA1的功能活性,下調(diào)蛋白和基因表達(dá)水平。SPCA1功能受損參與導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)鈣超載； 3. DAPK1的表達(dá)水平受氧糖剝奪再灌注的調(diào)節(jié)； 4. Smad2在氧糖剝奪再灌注中的作用與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)SPCA1的表達(dá)及功能、以及調(diào)節(jié)DAPK1的表達(dá)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2459652