【摘要】：目的檢測(cè)負(fù)載腫瘤/睪丸抗原NY-ESO-1多肽的人樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)體外特異性抗腫瘤的免疫效應(yīng),獲得能夠誘導(dǎo)CTL對(duì)多種腫瘤均產(chǎn)生較強(qiáng)殺傷作用的NY-ESO-1多肽,為腫瘤的免疫治療提供重要的理論依據(jù)。 方法 1.通過網(wǎng)站SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)的超基序法、結(jié)合多項(xiàng)式方案及量化基序法預(yù)測(cè)NY-ESO-1抗原表位,獲得三條HLA-A2限制性多肽并人工合成。 2.分別選擇HLA-A2表型陽性的人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H、結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤U251和HLA-A2表型陰性的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901,常規(guī)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞。 3.通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription PCR, RT-PCR)法和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞株NY-ESO-1的表達(dá)情況,對(duì)于NY-ESO-1陰性的腫瘤細(xì)胞,利用5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-CdR)誘導(dǎo)其重新表達(dá)NY-ESO-1。 4.聯(lián)合應(yīng)用重組人粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(recombination human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, rhGM-CSF)和白細(xì)胞介素4(recombination human interleukin-4, rhIL-4)誘導(dǎo)培養(yǎng)人臍帶血DC,腫瘤壞死因子(recombination human Tumor necrosis factor-α, rhTNF-α)誘導(dǎo)其成熟,通過倒置顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表達(dá)情況,進(jìn)行同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)鑒定DC功能。 5.聯(lián)合應(yīng)用重組人白細(xì)胞介素2(recombination human interleukin-2, rhIL-2)和植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)培養(yǎng)人臍帶血T淋巴細(xì)胞,通過NY-ESO-1多肽致敏DC,后者誘導(dǎo)CTL活化、擴(kuò)增。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放法檢測(cè)CTL對(duì)NY-ESO-1陽性腫瘤細(xì)胞的殺傷率,從而篩選出能夠誘導(dǎo)CTL對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均產(chǎn)生較強(qiáng)殺傷作用的NY-ESO-1多肽。 結(jié)果 1.獲得超基序法分值在20分以上的五條NY-ESO-1九肽,并結(jié)合多項(xiàng)式方案和量化基序法,選擇多項(xiàng)式系數(shù)和結(jié)合系數(shù)最高的三條NY-ESO-1九肽:p86-94(RLLEFYLAM)、p108-116(SLAQDAPPL)、p159-167(LMWITQCFL),通過化學(xué)合成法人工合成多肽。 2.成功篩選出NY-ESO-1陽性的人胃癌細(xì)胞株SGC-7901,而人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H、結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251均不表達(dá)NY-ESO-1。 3.通過5-Aza-CdR成功誘導(dǎo)NY-ESO-1陰性的人肝癌細(xì)胞MHCC97-H、結(jié)腸癌細(xì)胞SW480及腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251重新表達(dá)NY-ESO-1。 4.聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α從人臍帶血中成功培養(yǎng)獲得較多量DC,培養(yǎng)8天后細(xì)胞體積增大,半貼壁,形態(tài)不規(guī)則,有典型的樹枝狀突起,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不成熟DC(immature DC, imDC)和成熟DC(mature DC, mDC)表面分子HLA-DR、CD83、CD86的表達(dá)率分別為37.12%、3.77%、21.58%和93.53%、55.21%、69.12%,mDC能顯著刺激淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增。 5.通過LDH釋放法檢測(cè),負(fù)載NY-ESO-1p86-94多肽DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H、結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的殺傷率分別為42.41%±2.92%、32.27%±2.59%、36.59%±2.14%,顯著高于未負(fù)載多肽對(duì)照組的殺傷率(P0.05)。 結(jié)論 1.聯(lián)合應(yīng)用超基序法、多項(xiàng)式方案及量化基序法可以預(yù)測(cè)NY-ESO-1抗原表位。 2.5-Aza-CdR在體外能夠誘導(dǎo)NY-ESO-1陰性的腫瘤細(xì)胞株重新表達(dá)NY-ESO-1。 3.DC負(fù)載HLA-A2限制性NY-ESO-1多肽后,在體外能夠有效活化、擴(kuò)增CTL,誘導(dǎo)殺傷HLA-A2和NY-ESO-1均陽性的腫瘤細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)。 4.成功獲得一條能夠誘導(dǎo)CTL對(duì)人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H、結(jié)腸癌株SW480及腦膠質(zhì)瘤株U251均產(chǎn)生較強(qiáng)殺傷作用的NY-ESO-1多肽p86-94(RLLEFYLAM)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2446761