【摘要】：第一部分丁苯酞抗血小板聚集作用及其機(jī)制的研究 目的 血管損傷時(shí)血小板活化參與損傷修復(fù)反應(yīng),對(duì)于生理止血過(guò)程十分重要。病理性條件下如動(dòng)脈粥樣板塊自發(fā)性破裂或斑塊侵蝕等,循環(huán)血液中的血小板異�；罨纬蓜�(dòng)脈血栓將導(dǎo)致血管狹窄或閉塞,致使機(jī)體組織局部缺血或供血中斷。這些是冠心病、急性冠脈綜合征、缺血性腦卒中等當(dāng)今威脅我國(guó)人民及許多發(fā)達(dá)國(guó)家人民健康的首要疾病的病理基礎(chǔ)。隨著對(duì)血小板功能研究的不斷深入,研究表明抑制血小板活化的抗血小板藥對(duì)冠心病、中風(fēng)的預(yù)防、治療效果肯定。 丁苯酞(3-n-butylphthalide, NBP)是從芹菜籽中提取出來(lái)的特定成份并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而得到的新型化合物。2002年,丁苯酞(商品名為恩必普)獲得中國(guó)SFDA批準(zhǔn),成為我國(guó)腦血管領(lǐng)域第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類新藥。臨床試驗(yàn)證實(shí),口服制劑及針劑丁苯酞具有很強(qiáng)的抗腦缺血作用,對(duì)急性缺血性腦卒中的治療有滿意的療效,同時(shí)副作用較小。2010年,丁苯酞軟膠囊被編入我國(guó)《國(guó)家處方集》腦血管病指導(dǎo)用藥,臨床用于治療輕、中度急性缺血性腦卒中的各個(gè)病理過(guò)程。 以往的研究,使用體外、半體外比濁法證實(shí)丁苯酞對(duì)膠原、ADP、花生四烯酸誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集有明顯抑制作用；對(duì)大鼠灌胃給予丁苯酞后,觀察到左旋體和消旋體丁苯酞可劑量依賴性地抑制大鼠血栓形成,并能使剪鼠尾后的出血時(shí)間延長(zhǎng)2.1倍。然而,丁苯酞抗血栓、抗血小板作用的具體機(jī)制仍不明確。本研究對(duì)丁苯酞(消旋體及左旋體)體外抗人血小板聚集活性及其抗血小板的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了研究,從而對(duì)臨床應(yīng)用該藥物給出一定的參考價(jià)值。 方法 實(shí)驗(yàn)時(shí),我們當(dāng)場(chǎng)采集健康志愿獻(xiàn)血者的肘靜脈全血。使用FITC-PAC-1標(biāo)記血小板活化糖蛋白GPIIb/IIIa,通過(guò)全血法流式細(xì)胞儀檢測(cè)丁苯酞對(duì)人血小板活化的作用；我們制備了未經(jīng)阿斯匹林處理和經(jīng)阿司匹林處理人的洗滌系血小板,用丁苯酞(消旋體及左旋體)處理血小板后,加入血小板激動(dòng)劑ADP、凝血酶、膠原、U46619、花生四烯酸誘導(dǎo)血小板聚集,觀察并記錄其抗血小板聚集活性及對(duì)血小板ATP釋放的影響；對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討時(shí),我們使用柱層析法,加入[3H]腺嘌呤標(biāo)記,檢測(cè)丁苯酞對(duì)forsklin升高的ADP誘導(dǎo)的血小板內(nèi)cAMP水平的影響；通過(guò)使用高效液相法檢測(cè)酶反應(yīng)體系中剩余底物的含量,進(jìn)而反映丁苯酞對(duì)血小板提取的磷酸二酯酶(PDEs)活性的作用；此外,我們使用ELISA試劑盒,檢測(cè)丁苯酞對(duì)ADP、凝血酶、膠原誘導(dǎo)的血小板內(nèi)血栓烷A2生成的作用；最后,我們使用Fluo-3負(fù)載血小板,檢測(cè)丁苯酞對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板內(nèi)游Ca2+水平的影響。 結(jié)果 根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在全血條件下,丁苯酞(消旋體及左旋體)300μM可顯著抑制由ADP10μM誘導(dǎo)的血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的活化；在10-300μM范圍中,丁苯酞(消旋體及左旋體)可可顯著濃度依賴性地抑制由ADP10μM、凝血酶0.05U/mL、膠原1μg/mL、U466191μM、花生四烯酸0.5mM誘導(dǎo)的人洗滌血小板聚集和ATP釋放；同時(shí),我們觀察到丁苯酞對(duì)ADP、凝血酶誘導(dǎo)的聚集的抑制作用,在未經(jīng)阿司匹林處理?xiàng)l件下強(qiáng)于經(jīng)阿司匹林處理?xiàng)l件,而丁苯酞對(duì)U46619誘導(dǎo)的聚集的抑制作用在經(jīng)阿司匹林處理后反而相對(duì)更強(qiáng),提示其抗血小板作用可能與抑制TXA2的生成有關(guān)；丁苯酞(消旋體及左旋體)300μM在從人血小板提取的磷酸二酯酶反應(yīng)體系中,可顯著增高酶底物cAMP的剩余含量,證明丁苯酞有抑制磷酸二酯酶的作用；此外,丁苯酞(消旋體及左旋體)30μM對(duì)ADP10μM誘導(dǎo)的血小板內(nèi)cAMP降低的抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示其作用靶點(diǎn)非P2Y12-Gi信號(hào)通路；’最后,在10-300μM的濃度范圍內(nèi),丁苯酞濃度依賴性地顯著抑制ADP、凝血酶和膠原誘導(dǎo)的TXA2生成；丁苯酞(消旋體及左旋體)100μM能夠明顯降低由ADP10μM誘導(dǎo)的血小板內(nèi)Ca2+升高。 結(jié)論 1.丁苯酞(消旋體及左旋體)在體外對(duì)多種激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板激活具有較強(qiáng)的抑制作用。 2.丁苯酞(消旋體及左旋體)抗血小板作用的機(jī)制主要為抑制TXA2的生成和抑制磷酸二酯酶。 第二部分 NOD2在血小板中的表達(dá)與功能的研究 血小板是從骨髓來(lái)源巨核細(xì)胞上脫落下來(lái)的無(wú)核“細(xì)胞碎片”,流動(dòng)于機(jī)體血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)。血小板的主要功能是參與凝血和止血,限制血管損傷處進(jìn)一步出血。然而,血小板的異常激活將會(huì)導(dǎo)致急性冠脈綜合征、缺血性腦中風(fēng)等嚴(yán)重動(dòng)脈血栓性疾病。此外,血小板與動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程有關(guān)聯(lián)�；罨难“迥軌虮磉_(dá)分泌炎性因子如P-選擇素及CD40L等。許多在白細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)分子在血小板中也有表達(dá)。NOD作為白細(xì)胞表達(dá)的模式識(shí)別受體,在宿主抗侵入細(xì)菌的天然免疫(innate immunity)中具有重要作用。NOD主要有NOD1和NOD2。越來(lái)越多的證據(jù)表明,NOD2基因突變與炎癥性腸疾病Blau綜合征的發(fā)病有密切關(guān)聯(lián),也與克隆氏病的易感性增加相關(guān)。目前已知NOD2主要在單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá),但NOD2是否在血小板中表達(dá),以及是否在血小板有功能均未見報(bào)道。 我們首次發(fā)現(xiàn)血小板NOD2表達(dá)而且有功能。我們分別在mRNA水平及蛋白水平發(fā)現(xiàn)人及小鼠血小板表達(dá)高水平的NOD2,并發(fā)現(xiàn)野生型小鼠腹腔注射NOD2受體激動(dòng)劑MDP,能夠增強(qiáng)血小板激動(dòng)劑ADP、thrombin、collagen誘導(dǎo)的小鼠血小板聚集及ATP釋放,而NOD2受體敲除小鼠腹腔注射NOD2的激動(dòng)劑MDP,不能增強(qiáng)激動(dòng)劑ADP、thrombin、collagen誘導(dǎo)的血小板聚集及ATP釋放。接著,我們檢測(cè)了腹腔注射MDP對(duì)野性型及NOD2受體敲除小鼠血小板凝塊收縮和血小板鋪展的影響。結(jié)果顯示,MDP能夠顯著加快野生型小鼠血小板凝塊收縮速度,但是對(duì)血小板鋪展沒(méi)有明顯作用；NOD2受體敲除小鼠MDP組與NS組血小板凝塊收縮速度均相對(duì)減慢,兩組間無(wú)明顯差異；NOD2受體敲除小鼠MDP組與NS組血小板鋪展亦無(wú)明顯差異,并與野生型小鼠的血小板鋪展面積相似。最后,我們還應(yīng)用電鏡分析血小板的形態(tài)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)給予MDP刺激后野生型小鼠血小板明顯具有活化趨勢(shì),而對(duì)NOD2受體敲除小鼠血小板的結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的影響。我們的結(jié)論是血小板表達(dá)NOD2,NOD2激活促進(jìn)血小板活化。MDP激活NOD2后可能通過(guò)其下游MAPKs信號(hào)通路(包括p38、ERK、JNK)從而增強(qiáng)血小板的反應(yīng)性,相關(guān)研究正在進(jìn)行中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R3416

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本文編號(hào)：2446187