【摘要】：背景 新生隱球菌是一種具有莢膜的重要條件致病真菌,廣泛存在于自然界,對(duì)于一般健康人不致病,免疫力低下和免疫缺陷患者足此菌的易感人群。隱球菌病(Cryptococcosis)是由隱球菌屬中某些種或變種引起的腦膜、腦、肺、骨骼、皮膚或是全身慢性或亞急性甚至急性感染。近年來(lái)由于免疫抑制劑的使用和AIDS病的增多,新生隱球菌感染發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì),已經(jīng)成為一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。因此,新生隱球菌的研究已受到全球真菌研究學(xué)者的高度重視。 新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)主要致病途徑是以孢子的形式經(jīng)由呼吸道吸入,通過(guò)無(wú)癥狀的肺部感染,然后新生隱球菌穿越肺泡-毛細(xì)血管屏障入血引起其他深部組織感染(主要是中樞神經(jīng)系統(tǒng))。其發(fā)生的關(guān)鍵步驟為肺泡中的新生隱球菌穿越肺泡-毛細(xì)血管屏障,又稱(chēng)血?dú)馄琳?blood air barrier,BAB),位于肺泡與肺泡毛細(xì)血管之間,由六層組成：肺表面活性物質(zhì)的液體層；肺泡上皮細(xì)胞層；上皮基膜；肺泡與毛細(xì)血管之間的間隙；毛細(xì)血管的基膜；肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)。其功能是使肺泡中O2與毛細(xì)血管血液內(nèi)的CO2順利完成交換,并有防御病菌入侵和防止毛細(xì)血管內(nèi)其他物質(zhì)流失的作用。其中胚泡-毛細(xì)血管屏障主要的組成部分是肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。新生隱球菌成功穿越肺泡-毛細(xì)血管屏障需要經(jīng)過(guò)黏附及侵襲進(jìn)入肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,目前人們對(duì)新生隱球菌侵入肺泡-毛細(xì)血管屏障的分子機(jī)制所知甚少,是新生隱球菌疾病防治需解決的重要問(wèn)題。 多糖莢膜是新生隱球菌經(jīng)典的毒性因子,是新生隱球菌逃避宿主免疫的主要毒性因子。Ambrose Jong等研究表明：新生隱球菌莢膜成分-透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是由新生隱球菌的CPS1基因編碼合成,目前已經(jīng)利用染色體同源重組技術(shù),構(gòu)建了新生隱球菌B4500F02株的CPS1基因缺失株TYCC645#32, CPS1敲除菌株檢測(cè)不到HA,且對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附率明顯降低,證明HA作為一種粘附分子,在與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用過(guò)程中具有重要意義,是粘附腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要毒力因子。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上CD44是新生隱球菌HA的受體,新生隱球菌感染腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞后,經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使細(xì)胞骨架重排,使新生隱球菌進(jìn)入宿主細(xì)胞；CD44是屬于黏附因子家族的跨膜糖蛋白,它廣泛表達(dá)于多種內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、造血干細(xì)胞及中胚層來(lái)源的細(xì)胞和組織,分子量約80-95KD,可以與HA、GAG、膠原、層黏連蛋白、纖黏連蛋白、選擇蛋白等結(jié)合,由于在很多細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)CD44是HA的受體,我們推斷在HPMEC也存在CD44,新生隱球菌莢膜HA與HPMEC上的CD44結(jié)合是其入侵機(jī)制的一部分。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)于系統(tǒng)性研究新生隱球菌感染機(jī)理是至關(guān)重要的,常用的動(dòng)物模型主要有四種,分別為小鼠、豚鼠、大鼠和兔,其中小鼠是對(duì)新生隱球菌最為敏感的動(dòng)物,因此,小鼠是新生隱球菌研究最常用的動(dòng)物模型。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要、感染部位的不同,新生隱球菌目前常用的感染造模方法主要有腹腔、靜脈、鼻腔、氣管內(nèi)和顱內(nèi)注射接種等。由于新生隱球菌通常是由呼吸道吸入而引起感染,為明確莢膜HA是否參與新生隱球菌黏附和侵襲肺泡-毛細(xì)血管屏障的致病過(guò)程,需要通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察新生隱球菌穿越肺泡-毛細(xì)血管屏障的能力,要模擬其正常感染,可通過(guò)霧化吸入裝置的感染方式讓小鼠自然感染新生隱球菌,目前超聲霧化吸入已經(jīng)成功地應(yīng)用于多種動(dòng)物吸入性細(xì)菌感染,由于新生隱球菌感染主要發(fā)生于免疫力低下的人群中,因此研究新生隱球菌的致病機(jī)理包括應(yīng)用免疫抑制的動(dòng)物模型與新生隱球菌致病的關(guān)系。 目的 本研究將利用肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞HPMEC(human pulmonary microvascular endothelial cell)單層細(xì)胞,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)比較野生株及突變株對(duì)HPMEC的黏附和侵襲水平；利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù),比較兩者誘導(dǎo)HPMEC上CD44表達(dá)差異和肌動(dòng)蛋白重排的能力；利用免疫印跡技術(shù),比較兩者誘導(dǎo)HPMEC上CD44蛋白表達(dá)的差異；利用免疫抑制小鼠超聲霧化吸入新生隱球菌模型,明確HA是否影響致病菌穿越肺泡-毛細(xì)血管屏障的能力。 研究方法 1、真菌計(jì)數(shù)法檢測(cè)新生隱球菌對(duì)HPMEC細(xì)胞的粘附和侵襲率：實(shí)驗(yàn)前48小時(shí),將24孔板用膠原蛋白collagen包被半小時(shí),然后每孔接種105HPMEC,48小時(shí)后長(zhǎng)成單層備用。待測(cè)新生隱球菌于酵母YPD完全培養(yǎng)液中30℃250rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí),收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,PBS洗滌后并重懸于PBS稀釋備用,按感染倍數(shù)100,即新生隱球菌數(shù)：細(xì)胞數(shù)約100：1加入待測(cè)菌,每組三個(gè)復(fù)孔,同時(shí)留樣涂平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)獲得準(zhǔn)確新生隱球菌濃度。37℃孵育1、3和5小時(shí)后,PBS清洗3次后裂解細(xì)胞并涂布YPD平板計(jì)菌落數(shù),此為黏附與侵襲的新生隱球菌總數(shù),并計(jì)算黏附與侵襲率。 2、免疫熒光方法檢測(cè)新生隱球菌感染后HPMEC的CD44表達(dá)：細(xì)胞培養(yǎng)玻片用膠原蛋白collagen包被半小時(shí),每孔接種104HPMEC細(xì)胞,48小時(shí)后長(zhǎng)成單層,然后將106新生隱球菌B4500F02和TYCC645#32加到細(xì)胞單層上,并設(shè)置空白對(duì)照,37。C共同孵育3小時(shí),預(yù)冷的PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,5%BSA封閉,加入1：100CD44一抗4℃孵育過(guò)夜,回收一抗后用預(yù)冷的PBS洗3次,然后加1：100綠色熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育1小時(shí),預(yù)冷的PBS洗滌后,最后用抗熒光淬滅劑封片,24小時(shí)后熒光顯微鏡觀察。 3、免疫熒光方法檢測(cè)新生隱球菌感染后HPMEC的actin的表達(dá)：細(xì)胞培養(yǎng)玻片用膠原蛋白collagen包被半小時(shí),每孔接種104HPMEC細(xì)胞,48小時(shí)后長(zhǎng)成單層,然后將106新生隱球菌B4500F02和TYCC645#32加到細(xì)胞單層上,并設(shè)置空白對(duì)照,37。C共同孵育3小時(shí),預(yù)冷的PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,5%BSA封閉,然后在相應(yīng)孔中加入Rhodamine標(biāo)記的phalloidin (Sigma,1:300)室溫作用1h, PBS洗滌后,最后用抗熒光淬滅劑封片,24h后熒光顯微鏡觀察。 4、免疫印跡方法檢測(cè)新生隱球菌感染后HPMEC的CD44蛋白表達(dá)：直徑100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿用膠原蛋白collagen包被半小時(shí),每個(gè)培養(yǎng)皿接種約106HPMEC細(xì)胞,3天后長(zhǎng)成單層,然后將108新生隱球菌B4500F02和TYCC645#32加到細(xì)胞單層上,37℃共同孵育3小時(shí),預(yù)冷的PBS洗3次,再用RIPA裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞蛋白,然后進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),CD44抗體檢測(cè)細(xì)胞CD44表達(dá)情況。 5、動(dòng)物模型的建立：采用6周齡的Balb/c小鼠,用環(huán)磷酰胺(CTX)建立免疫抑制小鼠模型,然后采用超聲霧化器將新生隱球菌懸液霧化成汽霧顆粒,使小鼠在自主呼吸過(guò)程中吸入該菌,模擬新生隱球菌的正常侵入方式。感染后6h、3d和7d分別檢測(cè)血、肺和腦的菌落數(shù),并取肺組織,用2.5%福爾馬林固定,行HE染色和PAS染色病理檢查。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、新生隱球菌莢膜HA與其黏附與侵襲HPMEC細(xì)胞相關(guān)野生株B4500FO21、3和5小時(shí)的黏附與侵襲率分別為0.0123±0.0025%、0.055±0.0041%和0.012±0.0041%,而TYCC645#32各時(shí)間點(diǎn)黏附與侵襲率分別為0.005±0.0017%、0.025±0.0044%和0.0004±0.0007%, TYCC645#32各時(shí)間點(diǎn)黏附與侵襲率均低于B4500FO2相對(duì)應(yīng)時(shí)間的粘附與侵襲率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 2新生隱球菌莢膜HA促進(jìn)HPMEC細(xì)胞上CD44的表達(dá)應(yīng)用免疫熒光方法,我們發(fā)現(xiàn)CD44表達(dá)于HPMEC,經(jīng)新生隱球菌野生株感染的HPMEC的細(xì)胞膜上強(qiáng)的綠色熒光條帶,而在突變株孵育組熒光強(qiáng)度明顯弱于野生株組,未孵育新生隱球菌的正常HPMEC細(xì)胞綠色熒光很弱。并且通過(guò)免疫印跡方法,我們發(fā)現(xiàn)HPMEC表達(dá)CD44,特異性條帶出現(xiàn)在分子量約為95KD處,而且在內(nèi)參蛋白actin(分子量45KD)條帶基本一致,與新生隱球菌野生株共培養(yǎng)3小時(shí)后HPMEC的CD44蛋白表達(dá)增強(qiáng),而突變株孵育組CD44條帶明顯較弱。 3、新生隱球菌莢膜HA導(dǎo)致HPMEC細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白actin的改變應(yīng)用免疫熒光方法,我們發(fā)現(xiàn)被新生隱球菌野生株感染的HPMEC細(xì)胞胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白減少,紋理不清,出現(xiàn)邊緣聚集以及毛刺樣改變,而突變株孵育組也出現(xiàn)類(lèi)似情況,但改變程度明顯弱于野生株組,未孵育新生隱球菌的正常HPMEC組肌動(dòng)蛋白分布均勻。 4、新生隱球菌莢膜HA與其侵入免疫抑制小鼠肺組織相關(guān)6周齡的Balb/c小鼠被免疫抑制后,超聲霧化吸入新生隱球菌野生株B4500F02及突變株TYCC645#32,感染后6h、3d及7d后,血樣、肺及腦組織勻漿樣本涂布YPD平板計(jì)菌落數(shù)。感染后6h CPS1基因缺失株TYCC645#32組與野生株B4500FO2組肺部定植菌量相似(Z=-0.641,p0.05),然而在霧化吸入感染后3d和7d CPS1基因缺失株TYCC645#32組在外周血、肺和腦組織中的菌量均低于野生株B4500F02組。病理檢查發(fā)現(xiàn)B4500FO2組在感染后6h和3d肺泡炎癥彌漫,有充血滲出,7d基本正常；而TYCC645#32組只有在感染后6h肺泡及間質(zhì)有明顯炎癥,其他兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺泡結(jié)構(gòu)正常。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。野生株和突變株兩組間粘附與侵襲率的比較采用Mann-Whitney Test檢驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)外周血白細(xì)胞數(shù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)野生株和突變株兩組小鼠外周血CFU比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。肺和腦組織CFU總體的比較采用kruskal-wallis檢驗(yàn),進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法。P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件。 結(jié)論： 為了明確莢膜HA在新生隱球菌致病的相關(guān)作用,我們利用CPS1野生株和敲除株進(jìn)行體外、體內(nèi)肺泡-毛細(xì)血管屏障模型實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,在體外實(shí)驗(yàn)中,CPS1的基因敲除株TYCC645#32對(duì)HPMEC的黏附和侵襲水平明顯低于野生株B4500F02；與之一致的是,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中TYCC645#32穿越肺泡-毛細(xì)血管屏障的能力也低于B4500F02。 為了檢測(cè)CPS1基因敲除是否會(huì)對(duì)新生隱球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞CD44產(chǎn)生影響,我們將野生株及突變株與HPMEC孵育后,利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)B4500F02及突變株TYCC645#32感染后HPMEC的CD44表達(dá)情況,野生菌孵育組CD44蛋白表達(dá)更強(qiáng),在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出強(qiáng)的綠色熒光；而在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為CD44蛋白條帶明顯增粗,當(dāng)敲除CPS1后,突變株誘導(dǎo)HPMEC的CD44表達(dá)能力明顯弱于野生株組。 在許多致病菌入侵宿主細(xì)胞時(shí),都會(huì)造成宿主細(xì)胞骨架如肌動(dòng)蛋白的重排及下游信號(hào)通路的激活。這種情況同樣存在于新生隱球菌。為了檢測(cè)CPS1基因敲除是否會(huì)對(duì)新生隱球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排產(chǎn)生影響,我們將野生株及突變株與HPMEC呼育后,用羅丹明-鬼筆環(huán)肽對(duì)肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)在正常的HPMEC內(nèi),肌動(dòng)蛋白排列非常均勻。而野生株感染的HPMEC,肌動(dòng)蛋白在胞質(zhì)內(nèi)分布減少,而出現(xiàn)邊緣聚集現(xiàn)象,且可以觀察到突觸的形成。突變株處理過(guò)的HPMEC雖然也存在肌動(dòng)蛋白重排現(xiàn)象,但明顯弱于野生株。 綜合以上結(jié)果我們可以得出如下結(jié)論：莢膜HA與新生隱球菌通過(guò)肺泡-毛細(xì)血管屏障致病有著重要的關(guān)系,但莢膜HA與HPMEC的CD44結(jié)合后,又是通過(guò)怎樣具體的下游信號(hào)通路及機(jī)制來(lái)影響著新生隱球菌的侵入,將是我們后續(xù)研究中需要探索的問(wèn)題。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R379

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 黃欣,溫海,徐紅,朱元杰;馬拉色菌對(duì)三種唑類(lèi)抗真菌藥的體外藥敏試驗(yàn)[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年11期

2 朱元杰;溫海;徐紅;顧菊林;黃欣;趙瑾;;小鼠原發(fā)性皮膚新生隱球菌感染的實(shí)驗(yàn)研究[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年02期

3 鄭堅(jiān);羅冬英;;人體屏障的形態(tài)學(xué)特征及生理功能[J];黃岡師范學(xué)院學(xué)報(bào);2006年06期

4 王溪濤;溫海;徐赤宇;朱紅梅;;C57BL/6小鼠感染新生隱球菌對(duì)大腦皮質(zhì)BDNF和bFGF表達(dá)的影響[J];中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志;2007年07期

5 王志東;廖萬(wàn)清;徐紅;陶文照;;白念珠菌和新生隱球菌系統(tǒng)感染裸小鼠模型的建立[J];上海醫(yī)學(xué);2006年01期

6 雷靜靜;薄莉;周力;;胃腸隱球菌病1例[J];世界華人消化雜志;2011年09期

7 朱元杰;溫海;顧菊林;黃欣;潘煒華;徐紅;趙瑾;仇云;;莢膜在小鼠原發(fā)性皮膚新生隱球菌感染中的作用[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;2006年12期

8 朱元杰;顧菊林;陳江漢;趙瑾;仇蕓;溫海;;新生隱球菌對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞活力的作用研究[J];中國(guó)真菌學(xué)雜志;2011年01期

9 王曉蕾;薛辛東;;慢性高氧肺損傷新生鼠肺微血管超微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2007年11期

，

本文編號(hào)：2444498