【摘要】：背景 新生隱球菌是一種具有莢膜的重要條件致病真菌,廣泛存在于自然界,對于一般健康人不致病,免疫力低下和免疫缺陷患者足此菌的易感人群。隱球菌病(Cryptococcosis)是由隱球菌屬中某些種或變種引起的腦膜、腦、肺、骨骼、皮膚或是全身慢性或亞急性甚至急性感染。近年來由于免疫抑制劑的使用和AIDS病的增多,新生隱球菌感染發(fā)病率呈明顯上升趨勢,已經成為一種嚴重危害人類健康的疾病。因此,新生隱球菌的研究已受到全球真菌研究學者的高度重視。 新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)主要致病途徑是以孢子的形式經由呼吸道吸入,通過無癥狀的肺部感染,然后新生隱球菌穿越肺泡-毛細血管屏障入血引起其他深部組織感染(主要是中樞神經系統(tǒng))。其發(fā)生的關鍵步驟為肺泡中的新生隱球菌穿越肺泡-毛細血管屏障,又稱血氣屏障(blood air barrier,BAB),位于肺泡與肺泡毛細血管之間,由六層組成：肺表面活性物質的液體層；肺泡上皮細胞層；上皮基膜；肺泡與毛細血管之間的間隙；毛細血管的基膜；肺微血管內皮細胞(human pulmonary microvascular endothelial cell,HPMEC)。其功能是使肺泡中O2與毛細血管血液內的CO2順利完成交換,并有防御病菌入侵和防止毛細血管內其他物質流失的作用。其中胚泡-毛細血管屏障主要的組成部分是肺微血管內皮細胞。新生隱球菌成功穿越肺泡-毛細血管屏障需要經過黏附及侵襲進入肺微血管內皮細胞,目前人們對新生隱球菌侵入肺泡-毛細血管屏障的分子機制所知甚少,是新生隱球菌疾病防治需解決的重要問題。 多糖莢膜是新生隱球菌經典的毒性因子,是新生隱球菌逃避宿主免疫的主要毒性因子。Ambrose Jong等研究表明：新生隱球菌莢膜成分-透明質酸(hyaluronic acid,HA)是由新生隱球菌的CPS1基因編碼合成,目前已經利用染色體同源重組技術,構建了新生隱球菌B4500F02株的CPS1基因缺失株TYCC645#32, CPS1敲除菌株檢測不到HA,且對腦微血管內皮細胞的粘附率明顯降低,證明HA作為一種粘附分子,在與腦微血管內皮細胞相互作用過程中具有重要意義,是粘附腦微血管內皮細胞的重要毒力因子。腦微血管內皮細胞上CD44是新生隱球菌HA的受體,新生隱球菌感染腦微血管內皮細胞后,經過一系列信號轉導使細胞骨架重排,使新生隱球菌進入宿主細胞；CD44是屬于黏附因子家族的跨膜糖蛋白,它廣泛表達于多種內皮細胞、間充質細胞、造血干細胞及中胚層來源的細胞和組織,分子量約80-95KD,可以與HA、GAG、膠原、層黏連蛋白、纖黏連蛋白、選擇蛋白等結合,由于在很多細胞研究發(fā)現CD44是HA的受體,我們推斷在HPMEC也存在CD44,新生隱球菌莢膜HA與HPMEC上的CD44結合是其入侵機制的一部分。 動物實驗對于系統(tǒng)性研究新生隱球菌感染機理是至關重要的,常用的動物模型主要有四種,分別為小鼠、豚鼠、大鼠和兔,其中小鼠是對新生隱球菌最為敏感的動物,因此,小鼠是新生隱球菌研究最常用的動物模型。根據實驗需要、感染部位的不同,新生隱球菌目前常用的感染造模方法主要有腹腔、靜脈、鼻腔、氣管內和顱內注射接種等。由于新生隱球菌通常是由呼吸道吸入而引起感染,為明確莢膜HA是否參與新生隱球菌黏附和侵襲肺泡-毛細血管屏障的致病過程,需要通過動物實驗觀察新生隱球菌穿越肺泡-毛細血管屏障的能力,要模擬其正常感染,可通過霧化吸入裝置的感染方式讓小鼠自然感染新生隱球菌,目前超聲霧化吸入已經成功地應用于多種動物吸入性細菌感染,由于新生隱球菌感染主要發(fā)生于免疫力低下的人群中,因此研究新生隱球菌的致病機理包括應用免疫抑制的動物模型與新生隱球菌致病的關系。 目的 本研究將利用肺微血管內皮細胞HPMEC(human pulmonary microvascular endothelial cell)單層細胞,通過體外實驗比較野生株及突變株對HPMEC的黏附和侵襲水平；利用細胞免疫熒光技術,比較兩者誘導HPMEC上CD44表達差異和肌動蛋白重排的能力；利用免疫印跡技術,比較兩者誘導HPMEC上CD44蛋白表達的差異；利用免疫抑制小鼠超聲霧化吸入新生隱球菌模型,明確HA是否影響致病菌穿越肺泡-毛細血管屏障的能力。 研究方法 1、真菌計數法檢測新生隱球菌對HPMEC細胞的粘附和侵襲率：實驗前48小時,將24孔板用膠原蛋白collagen包被半小時,然后每孔接種105HPMEC,48小時后長成單層備用。待測新生隱球菌于酵母YPD完全培養(yǎng)液中30℃250rpm振蕩培養(yǎng)12小時,收集對數生長期細胞,PBS洗滌后并重懸于PBS稀釋備用,按感染倍數100,即新生隱球菌數：細胞數約100：1加入待測菌,每組三個復孔,同時留樣涂平板培養(yǎng)計數獲得準確新生隱球菌濃度。37℃孵育1、3和5小時后,PBS清洗3次后裂解細胞并涂布YPD平板計菌落數,此為黏附與侵襲的新生隱球菌總數,并計算黏附與侵襲率。 2、免疫熒光方法檢測新生隱球菌感染后HPMEC的CD44表達：細胞培養(yǎng)玻片用膠原蛋白collagen包被半小時,每孔接種104HPMEC細胞,48小時后長成單層,然后將106新生隱球菌B4500F02和TYCC645#32加到細胞單層上,并設置空白對照,37。C共同孵育3小時,預冷的PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,5%BSA封閉,加入1：100CD44一抗4℃孵育過夜,回收一抗后用預冷的PBS洗3次,然后加1：100綠色熒光標記的羊抗兔二抗孵育1小時,預冷的PBS洗滌后,最后用抗熒光淬滅劑封片,24小時后熒光顯微鏡觀察。 3、免疫熒光方法檢測新生隱球菌感染后HPMEC的actin的表達：細胞培養(yǎng)玻片用膠原蛋白collagen包被半小時,每孔接種104HPMEC細胞,48小時后長成單層,然后將106新生隱球菌B4500F02和TYCC645#32加到細胞單層上,并設置空白對照,37。C共同孵育3小時,預冷的PBS洗3次,4%多聚甲醛固定,5%BSA封閉,然后在相應孔中加入Rhodamine標記的phalloidin (Sigma,1:300)室溫作用1h, PBS洗滌后,最后用抗熒光淬滅劑封片,24h后熒光顯微鏡觀察。 4、免疫印跡方法檢測新生隱球菌感染后HPMEC的CD44蛋白表達：直徑100mm細胞培養(yǎng)皿用膠原蛋白collagen包被半小時,每個培養(yǎng)皿接種約106HPMEC細胞,3天后長成單層,然后將108新生隱球菌B4500F02和TYCC645#32加到細胞單層上,37℃共同孵育3小時,預冷的PBS洗3次,再用RIPA裂解細胞,提取細胞蛋白,然后進行免疫印跡實驗,CD44抗體檢測細胞CD44表達情況。 5、動物模型的建立：采用6周齡的Balb/c小鼠,用環(huán)磷酰胺(CTX)建立免疫抑制小鼠模型,然后采用超聲霧化器將新生隱球菌懸液霧化成汽霧顆粒,使小鼠在自主呼吸過程中吸入該菌,模擬新生隱球菌的正常侵入方式。感染后6h、3d和7d分別檢測血、肺和腦的菌落數,并取肺組織,用2.5%福爾馬林固定,行HE染色和PAS染色病理檢查。 實驗結果 1、新生隱球菌莢膜HA與其黏附與侵襲HPMEC細胞相關野生株B4500FO21、3和5小時的黏附與侵襲率分別為0.0123±0.0025%、0.055±0.0041%和0.012±0.0041%,而TYCC645#32各時間點黏附與侵襲率分別為0.005±0.0017%、0.025±0.0044%和0.0004±0.0007%, TYCC645#32各時間點黏附與侵襲率均低于B4500FO2相對應時間的粘附與侵襲率,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。 2新生隱球菌莢膜HA促進HPMEC細胞上CD44的表達應用免疫熒光方法,我們發(fā)現CD44表達于HPMEC,經新生隱球菌野生株感染的HPMEC的細胞膜上強的綠色熒光條帶,而在突變株孵育組熒光強度明顯弱于野生株組,未孵育新生隱球菌的正常HPMEC細胞綠色熒光很弱。并且通過免疫印跡方法,我們發(fā)現HPMEC表達CD44,特異性條帶出現在分子量約為95KD處,而且在內參蛋白actin(分子量45KD)條帶基本一致,與新生隱球菌野生株共培養(yǎng)3小時后HPMEC的CD44蛋白表達增強,而突變株孵育組CD44條帶明顯較弱。 3、新生隱球菌莢膜HA導致HPMEC細胞骨架肌動蛋白actin的改變應用免疫熒光方法,我們發(fā)現被新生隱球菌野生株感染的HPMEC細胞胞質肌動蛋白減少,紋理不清,出現邊緣聚集以及毛刺樣改變,而突變株孵育組也出現類似情況,但改變程度明顯弱于野生株組,未孵育新生隱球菌的正常HPMEC組肌動蛋白分布均勻。 4、新生隱球菌莢膜HA與其侵入免疫抑制小鼠肺組織相關6周齡的Balb/c小鼠被免疫抑制后,超聲霧化吸入新生隱球菌野生株B4500F02及突變株TYCC645#32,感染后6h、3d及7d后,血樣、肺及腦組織勻漿樣本涂布YPD平板計菌落數。感染后6h CPS1基因缺失株TYCC645#32組與野生株B4500FO2組肺部定植菌量相似(Z=-0.641,p0.05),然而在霧化吸入感染后3d和7d CPS1基因缺失株TYCC645#32組在外周血、肺和腦組織中的菌量均低于野生株B4500F02組。病理檢查發(fā)現B4500FO2組在感染后6h和3d肺泡炎癥彌漫,有充血滲出,7d基本正常；而TYCC645#32組只有在感染后6h肺泡及間質有明顯炎癥,其他兩個時間點肺泡結構正常。 統(tǒng)計學分析： 數據均表示為均數±標準差。野生株和突變株兩組間粘附與侵襲率的比較采用Mann-Whitney Test檢驗。動物實驗外周血白細胞數的比較采用配對t檢驗。動物實驗野生株和突變株兩組小鼠外周血CFU比較采用兩樣本t檢驗。肺和腦組織CFU總體的比較采用kruskal-wallis檢驗,進一步兩兩比較采用Bonferroni法。P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,檢驗水準為α=0.05。數據分析采用SPSS17.0軟件。 結論： 為了明確莢膜HA在新生隱球菌致病的相關作用,我們利用CPS1野生株和敲除株進行體外、體內肺泡-毛細血管屏障模型實驗對相關機制進行了研究。結果顯示,在體外實驗中,CPS1的基因敲除株TYCC645#32對HPMEC的黏附和侵襲水平明顯低于野生株B4500F02；與之一致的是,體內實驗中TYCC645#32穿越肺泡-毛細血管屏障的能力也低于B4500F02。 為了檢測CPS1基因敲除是否會對新生隱球菌誘導的細胞CD44產生影響,我們將野生株及突變株與HPMEC孵育后,利用細胞免疫熒光技術和免疫印跡技術檢測B4500F02及突變株TYCC645#32感染后HPMEC的CD44表達情況,野生菌孵育組CD44蛋白表達更強,在細胞免疫熒光實驗中表現出強的綠色熒光；而在免疫印跡實驗中表現為CD44蛋白條帶明顯增粗,當敲除CPS1后,突變株誘導HPMEC的CD44表達能力明顯弱于野生株組。 在許多致病菌入侵宿主細胞時,都會造成宿主細胞骨架如肌動蛋白的重排及下游信號通路的激活。這種情況同樣存在于新生隱球菌。為了檢測CPS1基因敲除是否會對新生隱球菌誘導的細胞骨架重排產生影響,我們將野生株及突變株與HPMEC呼育后,用羅丹明-鬼筆環(huán)肽對肌動蛋白進行染色,發(fā)現在正常的HPMEC內,肌動蛋白排列非常均勻。而野生株感染的HPMEC,肌動蛋白在胞質內分布減少,而出現邊緣聚集現象,且可以觀察到突觸的形成。突變株處理過的HPMEC雖然也存在肌動蛋白重排現象,但明顯弱于野生株。 綜合以上結果我們可以得出如下結論：莢膜HA與新生隱球菌通過肺泡-毛細血管屏障致病有著重要的關系,但莢膜HA與HPMEC的CD44結合后,又是通過怎樣具體的下游信號通路及機制來影響著新生隱球菌的侵入,將是我們后續(xù)研究中需要探索的問題。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R379

【參考文獻】

相關期刊論文 前9條

1 黃欣,溫海,徐紅,朱元杰;馬拉色菌對三種唑類抗真菌藥的體外藥敏試驗[J];第二軍醫(yī)大學學報;2005年11期

2 朱元杰;溫海;徐紅;顧菊林;黃欣;趙瑾;;小鼠原發(fā)性皮膚新生隱球菌感染的實驗研究[J];第二軍醫(yī)大學學報;2006年02期

3 鄭堅;羅冬英;;人體屏障的形態(tài)學特征及生理功能[J];黃岡師范學院學報;2006年06期

4 王溪濤;溫海;徐赤宇;朱紅梅;;C57BL/6小鼠感染新生隱球菌對大腦皮質BDNF和bFGF表達的影響[J];中國麻風皮膚病雜志;2007年07期

5 王志東;廖萬清;徐紅;陶文照;;白念珠菌和新生隱球菌系統(tǒng)感染裸小鼠模型的建立[J];上海醫(yī)學;2006年01期

6 雷靜靜;薄莉;周力;;胃腸隱球菌病1例[J];世界華人消化雜志;2011年09期

7 朱元杰;溫海;顧菊林;黃欣;潘煒華;徐紅;趙瑾;仇云;;莢膜在小鼠原發(fā)性皮膚新生隱球菌感染中的作用[J];中國皮膚性病學雜志;2006年12期

8 朱元杰;顧菊林;陳江漢;趙瑾;仇蕓;溫海;;新生隱球菌對角質形成細胞活力的作用研究[J];中國真菌學雜志;2011年01期

9 王曉蕾;薛辛東;;慢性高氧肺損傷新生鼠肺微血管超微結構的動態(tài)變化[J];中國現代醫(yī)學雜志;2007年11期

，

本文編號：2444498