【摘要】：接觸抑制現(xiàn)象具有重要的生理意義,其與機(jī)體內(nèi)器官,組織的形態(tài)、大小以及各類細(xì)胞數(shù)量的控制有著密切的關(guān)系。機(jī)體的組織器官生長到一定程度后會(huì)自然停止生長,而不是無限制的長大;在體外培養(yǎng)過程中,當(dāng)細(xì)胞分裂增殖到一定程度,達(dá)到相互接觸時(shí),細(xì)胞停止分裂。一般認(rèn)為,接觸抑制是由于細(xì)胞數(shù)量的增加消耗了局部區(qū)域的促分裂因子;另一方面是細(xì)胞接觸時(shí)自身分泌了一些細(xì)胞增殖的抑制因子。2001年Nakatsuji Y [1]等人]的研究表明:星形膠質(zhì)細(xì)胞的接觸抑制是通過介導(dǎo)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的,而細(xì)胞密度能夠調(diào)控一系列關(guān)鍵細(xì)胞周期蛋白水平的表達(dá),可能是通過控制細(xì)胞周期的進(jìn)程而實(shí)現(xiàn)。我們以星形膠質(zhì)細(xì)胞做為模型細(xì)胞,了解接觸抑制的機(jī)理并探討接觸抑制與細(xì)胞周期調(diào)控間的相互關(guān)系。 細(xì)胞周期調(diào)控是細(xì)胞的基本生理功能,其不僅控制細(xì)胞的分裂增殖,而且決定著細(xì)胞的分化及死亡;同時(shí),細(xì)胞周期調(diào)控對(duì)于細(xì)胞的許多重要生理功能亦有至關(guān)重要的作用。因此,有理由相信,在細(xì)胞生長發(fā)育的整個(gè)階段,都有可能在細(xì)胞周期的調(diào)控下逐漸進(jìn)展。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白是一組功能各異、相互聯(lián)系、相互制約的核蛋白,按其對(duì)細(xì)胞周期的作用分為細(xì)胞周期正控蛋白(包括Cyclin、CDK和pRb)和細(xì)胞周期負(fù)控蛋白(CKI家族)。細(xì)胞周期蛋白Cyclin作為一類隨細(xì)胞周期變化而循環(huán)出現(xiàn)和消失的蛋白質(zhì),它是從酵母到人類等真核生物中有廣泛作用的分子。Cyclin在正常細(xì)胞周期調(diào)控中有重要作用。目前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了20多種Cyclin。對(duì)細(xì)胞周期有明確調(diào)控作用的主要是CyclinA、B、C、D和E, Cyclin分子在進(jìn)化上有高度的保守性,其分子結(jié)構(gòu)上都有一段“Cyclin盒”序列,Cyclin通過與CDK形成復(fù)合物發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期或轉(zhuǎn)錄的功能;CDK含量在細(xì)胞周期的各階段相對(duì)恒定,其活性由于Cyclin的調(diào)節(jié)作用有所變化,CDK必須與相應(yīng)的Cyclin結(jié)合,并且在一定部位發(fā)生磷酸化或去磷酸化才能有活性或被滅活,Cyclin及其相關(guān)分子是目前細(xì)胞周期調(diào)控研究中的熱點(diǎn)。細(xì)胞周期負(fù)控蛋白(CKI家族)包括P21,P27,P57等,可抑制已知的大多數(shù)Cyclin-CDK復(fù)合物的激酶活性,對(duì)G1期的早期與晚期、S期等各期都有重要作用,且分布與功能在不同的細(xì)胞各異,是目前的主要研究對(duì)象。 為了了解星形膠質(zhì)細(xì)胞在接觸抑制時(shí)相關(guān)的分子機(jī)制,我們選取三種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinA、CyclinD1和P27作為標(biāo)志物,觀察它們?cè)谛切文z質(zhì)細(xì)胞增殖和接觸抑制過程中的表達(dá)情況,探討接觸抑制與細(xì)胞周期調(diào)控間的相互關(guān)系。本研究在體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件下,檢測其處于半?yún)R合狀態(tài)時(shí),以及處于匯合狀態(tài)時(shí)CyclinA、CyclinD1與P27等三種蛋白的表達(dá)情況。將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),分別在其處于半?yún)R合狀態(tài)與匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。一、采用免疫組化染色,將半?yún)R合與匯合的細(xì)胞與上述三種蛋白的抗體反應(yīng),對(duì)結(jié)果進(jìn)行定性分析并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。二、采用RT-PCR技術(shù),分別于半?yún)R合與匯合時(shí)期檢測上述三種蛋白mRNA的表達(dá),將細(xì)胞裂解離心制成RNA樣品,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,產(chǎn)物擴(kuò)增,對(duì)其進(jìn)行跑膠,顯影,并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。免疫組化結(jié)果顯示:與半?yún)R合時(shí)細(xì)胞相比,星形膠質(zhì)細(xì)胞匯合時(shí)CyclinA表達(dá)顯著下降(p0.05),CyclinD1表達(dá)顯著下降(p0.05),而P27表達(dá)顯著升高(p0.01);RT-PCR結(jié)果顯示:與半?yún)R合時(shí)細(xì)胞相比,星形膠質(zhì)細(xì)胞在匯合時(shí)CyclinA mRNA表達(dá)顯著下降(p0.01),CyclinD1 mRNA表達(dá)顯著下降(p0.05),而P27 mRNA表達(dá)顯著升高(p0.01)。 結(jié)論:星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)情況下,細(xì)胞處于半?yún)R合狀態(tài)時(shí),細(xì)胞周期正向調(diào)節(jié)因子CyclinA、CyclinD1高表達(dá),而細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)節(jié)因子P27低表達(dá),表明細(xì)胞處于增殖旺盛期;當(dāng)細(xì)胞處于接觸匯合期時(shí),CyclinA、CyclinD1低表達(dá)狀態(tài),而P27高表達(dá),表明細(xì)胞處于增殖抑制期。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 馬俊芳;劉仁剛;羅賢雯;彭會(huì)明;周潔萍;王偉;;抗CD81抗體與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖抑制的時(shí)效關(guān)系[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2008年03期

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本文編號(hào)：2444395