【摘要】：隨著我國快速交通行業(yè)的飛速發(fā)展、逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì),創(chuàng)傷、感染、退行性改變的發(fā)生日益增加,造成以關(guān)節(jié)軟骨損傷為病理學(xué)基礎(chǔ)的軟骨缺損、骨關(guān)節(jié)炎等疾患,其所造成的關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙已成為臨床常見病與多發(fā)病,是一直是威脅人類生命健康的常見疾病,軟骨損傷的修復(fù)是當(dāng)前國際骨科學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)以及生物材料學(xué)界研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問題,對(duì)此進(jìn)行相關(guān)研究具有重要意義。 但軟骨損傷后自愈能力極差,原因可能與其細(xì)胞構(gòu)成單一為已經(jīng)分化成熟的軟骨細(xì)胞及無血液和淋巴營養(yǎng)有關(guān)。軟骨一旦發(fā)生損傷或者缺損往往會(huì)伴發(fā)軟骨下骨的改變,軟骨下骨作為關(guān)節(jié)軟骨的堅(jiān)強(qiáng)支撐,對(duì)于關(guān)節(jié)內(nèi)應(yīng)力傳導(dǎo)發(fā)揮著重要作用。骨軟骨缺損一旦發(fā)生,由于失去了堅(jiān)強(qiáng)的軟骨下骨支撐,軟骨面局部的應(yīng)力異常分布及塌陷難以避免,使關(guān)節(jié)發(fā)生不可逆性的退變,造成關(guān)節(jié)內(nèi)異常骨化并最終強(qiáng)直,引起強(qiáng)烈、持續(xù)的關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙。 目前臨床上較為成熟的軟骨修復(fù)技術(shù)包括骨髓刺激和移植兩大類：前者如軟骨下鉆孔術(shù)和微骨折技術(shù)；后者有自體骨軟骨鑲嵌成型術(shù)(Mosaicplasty)和自體軟骨細(xì)胞移植(ACI)術(shù)。但上述技術(shù)本身均有其各自諸多的局限性。骨髓刺激技術(shù)僅能在修復(fù)區(qū)產(chǎn)生纖維軟骨覆蓋；而Mosaicplasty技術(shù)雖能恢復(fù)透明軟骨覆蓋,但其畢竟破壞了正常的健康組織,且供區(qū)有限難以滿足更大面積缺損的需要,而可能產(chǎn)生的供區(qū)病也限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用；ACI技術(shù)的修復(fù)效果令人振奮,但形成的軟骨組織究竟是否透明軟骨無法預(yù)期且手術(shù)復(fù)雜,價(jià)格昂貴。而更有研究表明,ACI所產(chǎn)生的軟骨難以與軟骨下骨宿主緊密結(jié)合,特別是在骨軟骨復(fù)合型損傷情況下,ACI無法恢復(fù)軟骨下骨的生物力學(xué)支撐,使得其在面對(duì)骨軟骨復(fù)合型缺損時(shí)失去了優(yōu)勢。 基于上述原因,迄今為止關(guān)節(jié)軟骨損傷的臨床療效始終差強(qiáng)人意,更缺乏可以大規(guī)模臨床應(yīng)用的成熟的人工替代材料和組織工程關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)品,組織工程學(xué)的發(fā)展為軟骨缺損尤其是骨軟骨復(fù)合缺損的修復(fù)提供了新的思路和技術(shù)方法,自從在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建出耳廓軟骨的這一組織工程學(xué)標(biāo)志性成果發(fā)表至今10余年時(shí)間內(nèi),對(duì)于組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的構(gòu)建與應(yīng)用已進(jìn)行了大量的研究工作,已在體外及多種動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建出組織工程化軟骨,充分顯示了組織工程學(xué)方法與技術(shù)在修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷中的巨大潛力與廣闊的應(yīng)用前景。 采用生物材料復(fù)合各種細(xì)胞的軟骨組織工程,是目前研究的熱點(diǎn),有很好的臨床應(yīng)用前景,已有部分技術(shù)、產(chǎn)品應(yīng)用于臨床,其技術(shù)主要包括種子細(xì)胞、支架材料和局部培養(yǎng)及誘導(dǎo)微環(huán)境三個(gè)方面,本實(shí)驗(yàn)主要在種子細(xì)胞和支架材料方面研究。 軟骨組織工程的種子細(xì)胞的較好來源之一是向成軟骨分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),其中用軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞方向分化是一種實(shí)用的策略。軟骨修復(fù)常用的大動(dòng)物模型是山羊,然而關(guān)于山羊軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)國內(nèi)研究很少。BMSCs作為種子細(xì)胞有很好的應(yīng)用前景,但是如何完美的誘導(dǎo)其向成軟骨細(xì)胞分化,沒有標(biāo)準(zhǔn)的方案,共培養(yǎng)誘導(dǎo)BMSCs向成軟骨分化是可選的方案,其誘導(dǎo)效果不同物種有差異,且誘導(dǎo)效果不統(tǒng)一,有些研究BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)BMSCs向成骨分化,有些研究BMSCs向成軟骨分化,故進(jìn)一步驗(yàn)證大動(dòng)物細(xì)胞共培養(yǎng)成是否成軟骨仍有意義 本實(shí)驗(yàn)第一部分重點(diǎn)觀察山羊第三代軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)是否仍能 應(yīng)用于臨床的第一二代自體軟骨細(xì)胞植入術(shù)(ACI)軟骨修復(fù)產(chǎn)品都存在著軟骨的去分化問題,軟骨去分化后變成纖維細(xì)胞樣外觀,細(xì)胞外基質(zhì)collagenⅡ、GAG減少,collagen Ⅰ增加形成的透明軟骨質(zhì)量下降,一般第四代后開始表現(xiàn)明顯,早期的共培養(yǎng)采用的軟骨細(xì)胞一般是第二代(p2)以前的細(xì)胞,本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)觀察山羊第三代軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)是否仍能通過旁分泌誘導(dǎo)BMSCs向成軟骨分化。本研究的主要研究方法、內(nèi)容和結(jié)論包括以下幾個(gè)方面： 目的： 獲取用于作為種子細(xì)胞的兩種細(xì)胞,并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增、鑒定 方法： 1.山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取、擴(kuò)增與鑒定 用全骨髓法貼壁培養(yǎng)純化山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,用含10%FBS的低糖培養(yǎng)液在37。5%C02環(huán)境下培養(yǎng)擴(kuò)增,將第三代BMSCs分別向成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)鑒定其多項(xiàng)分化能力,并做流式細(xì)胞鑒定其表面特征性CD分子。 2.山羊肋軟骨細(xì)胞的獲取擴(kuò)增與鑒定 取山羊第12肋末端3cm,剪碎、胰酶、膠原酶程序消化,貼壁培養(yǎng)獲取的軟骨細(xì)胞在含10%FBS的低糖培養(yǎng)液在37。5%C02環(huán)境下培養(yǎng)擴(kuò)增,進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色鑒定其分泌細(xì)胞外基質(zhì)能力。 結(jié)果： 成功分離、擴(kuò)增出兩種細(xì)胞,經(jīng)鑒定復(fù)合上述BMSCs和山羊肋軟骨細(xì)胞特征。結(jié)論： 全骨髓培養(yǎng)法能夠獲取實(shí)驗(yàn)要求的較高純度BMSCs,復(fù)合酶程序消化法能獲取符合要求的肋軟骨細(xì)胞。 目的： 觀察與肋軟骨細(xì)胞平面隔離共培養(yǎng)條件下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨分化的能力 方法： 1. Transwell共培養(yǎng)體系的建立 將獲取擴(kuò)增的肋軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別種植于Transwell共培養(yǎng)板的小室層和孔板的底層,分2周、3周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)軟骨誘導(dǎo),為實(shí)驗(yàn)組,相同細(xì)胞量種植于六孔板培養(yǎng)為陰性對(duì)照組,相同細(xì)胞量種植于六孔板用成軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)為陽性性對(duì)照組。 2.共培養(yǎng)時(shí)間終點(diǎn)干細(xì)胞成軟骨的檢測 2.1大體形態(tài)改變觀察、甲苯胺藍(lán)染色及二型膠原(collagenll)免疫熒光 2.2GAG定量檢測評(píng)價(jià)共培養(yǎng)后BMSCs分泌透明軟骨主要細(xì)胞外基質(zhì)的能力 2.3Q-PCR檢測成軟骨及成骨基因表達(dá) 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)分析采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,Alamarblue法檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,相同時(shí)間點(diǎn)兩組之間的比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；GAG定量、Q-PCR檢測實(shí)驗(yàn)中同一時(shí)間點(diǎn)不同組比較方差齊時(shí)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析(one-wayANOVA),方差齊時(shí)用整體比較用F檢驗(yàn),多重比較用LSD法后檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)用Welch近似F檢驗(yàn),多重比較用Dunnett'sT3法后檢驗(yàn)。a=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 結(jié)果：共培養(yǎng)的過程中,BMSCs逐漸由長條狀螺旋形排列纖維細(xì)胞樣,轉(zhuǎn)變?yōu)橛|角短的多角形上皮樣細(xì)胞,甲苯胺藍(lán)染色見共培養(yǎng)組有異染現(xiàn)象,對(duì)照組無異染情況,說明有酸性的GAG分泌增多；共培養(yǎng)組與陰性對(duì)照組相比,增殖能力在7天后被抑制(7天t=6.492p=0.003；9天t=16.186p=0.000；11天t=5.062p=0.007)；在7天和21天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)GAG定量檢測共培養(yǎng)組(A組)與陰性對(duì)照組(C組)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(7天F=98.956p=0.002；21天F=905.167p=0.000,后檢驗(yàn),7天t=40.877p=0.018；21天t=151.341p=0.000),21天時(shí)共培養(yǎng)組的GAG含量低于成軟骨誘導(dǎo)液組(總體組間有差異21天F=905.167p=0.000),后檢驗(yàn)t=55.930p=0.000)。Q-PCR檢測見14天時(shí)共培養(yǎng)組(A組)、成軟骨誘導(dǎo)液組(B組)成軟骨基因ColⅡ較陰性對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)(總體組間F=905.167p=0.000,后檢驗(yàn)與C組相比A組t=1.1693p=0.000B組t=1.940p=0.000),但是伴隨成骨基因osteopontin的表達(dá)增強(qiáng)(總體組間F=15.989p=0.004,后檢驗(yàn)與C組相比A組t=3.811p=0.001B組t=2.647p=0.009)。 結(jié)論： 用第三代的山羊肋軟骨細(xì)胞與山羊第四代BMSCs共培養(yǎng),能在一定程度上誘導(dǎo)山羊BMSCs向成軟骨分化,誘導(dǎo)效果弱于成軟骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo),但是兩種誘導(dǎo)方法都伴隨有成骨基因的表達(dá),可能遠(yuǎn)期有成骨趨勢,需引起注意。 目的： 觀察三維培養(yǎng)環(huán)境中的干細(xì)胞與平面培養(yǎng)的肋軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)下,向成軟骨分化的能力 方法： 1.支架材料與細(xì)胞的復(fù)合、共培養(yǎng)體系的建立 用滴加法將1×107/ml的細(xì)胞懸液滴加到已經(jīng)消毒、預(yù)濕的6mmx4mm的PLGA圓薄片支架材料上,貼壁后構(gòu)建成細(xì)胞材料復(fù)合體。將細(xì)胞材料復(fù)合體放入底部預(yù)接種山羊肋軟骨細(xì)胞的24孔板中培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組,將細(xì)胞材料復(fù)合體放入底部未預(yù)接種山羊肋軟骨細(xì)胞的24孔板中培養(yǎng)為對(duì)照組。 2.共培養(yǎng)時(shí)間終點(diǎn)干細(xì)胞成軟骨的檢測 共培養(yǎng)21天后,取出細(xì)胞材料復(fù)合體,石蠟包埋切片后做HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、Col Ⅱ免疫組化等組織學(xué)檢測,評(píng)價(jià)其是否分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)增多。結(jié)果： 共培養(yǎng)21天后HE染色兩組未見明顯差別,支架材料的空隙中布滿接種細(xì)胞,并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)。甲苯胺藍(lán)染色見共培養(yǎng)組異染明顯,對(duì)照組未見明顯異染,ColⅡ免疫組化免疫組化示共培養(yǎng)組陽性,對(duì)照組陰性 結(jié)論： 三維支架材料中的山羊BMSCs在有肋軟骨的環(huán)境下,組織學(xué)檢測見成軟骨基質(zhì)分泌增多,可用來誘導(dǎo)或者協(xié)同誘導(dǎo)支架材料中負(fù)載的BMSCs向成軟骨分化,細(xì)胞材料復(fù)合體可直接用于進(jìn)一步的軟骨缺損手術(shù)修復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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8 朱，

本文編號(hào)：2443594