【摘要】：細(xì)菌耐藥,是指細(xì)菌能在殺死它們或削弱它們的藥物中獲得生存的本能。細(xì)菌耐藥性的來源有兩個途徑,即自身基因突變和耐藥基因的獲得。外源性耐藥基因的獲取,是細(xì)菌耐藥性廣泛散播的主要原因,一般通過可移動遺傳元件完成,如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列共同區(qū)(ISCR)等。 質(zhì)粒是一種獨立的、可自我復(fù)制的遺傳元件,自身可攜帶耐藥基因,亦可作為其他可移動遺傳元件的載體,介導(dǎo)菌株間基因水平轉(zhuǎn)移,在耐藥基因的擴散過程中扮演著關(guān)鍵角色。因此研究質(zhì)粒DNA的結(jié)構(gòu),分析質(zhì)粒所攜帶的功能基因及質(zhì)粒與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系,對細(xì)菌耐藥分子機制的深入研究具有重要意義。 為了系統(tǒng)研究基因的水平轉(zhuǎn)移,本課題組已選用對抗生素敏感的一株福氏志賀菌Z23作為受體菌,以臨床分離的耐多藥大腸桿菌E667為供體菌,通過接合轉(zhuǎn)移實驗構(gòu)建了多重耐藥轉(zhuǎn)移菌株ZT,并通過抑制性消減雜交實驗篩選出一部分序列,斑點雜交試驗結(jié)果表明這些序列在供體菌及轉(zhuǎn)移菌株的質(zhì)粒上均存在,克隆轉(zhuǎn)化實驗發(fā)現(xiàn)這些序列與細(xì)菌耐藥有關(guān)(故之后稱這些序列為耐藥相關(guān)序列)。但是含有這些耐藥相關(guān)序列的質(zhì)粒是否為耐藥質(zhì)粒,是否為接合質(zhì)粒,介導(dǎo)供體菌和受體菌之間耐藥性的傳遞,仍需進(jìn)一步驗證。故本課題將通過轉(zhuǎn)化實驗獲得含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子,分析該質(zhì)粒與耐藥性的關(guān)系,對該質(zhì)粒上的耐藥基因進(jìn)行篩選,檢測該質(zhì)粒上所存在的與耐藥相關(guān)的可移動遺傳元件,以探索該質(zhì)粒在耐藥過程中所起的作用及其耐藥機制,為更全面的了解質(zhì)粒所介導(dǎo)的耐藥分子機制提供基礎(chǔ)資料。 方法 1陽性克隆的獲得：通過改進(jìn)分子克隆上面的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實驗方法,降低預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、預(yù)培養(yǎng)溫度及延長預(yù)培養(yǎng)時間,將實驗室儲存的志賀菌屬細(xì)菌質(zhì)粒(該質(zhì)粒來源于通過接合轉(zhuǎn)移實驗獲得的耐多藥的志賀菌屬轉(zhuǎn)移株ZT,供體菌為臨床分離的耐多藥的大腸桿菌E667,受體菌為敏感的福氏志賀菌Z23)轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH-5α中,分別涂布在含單一抗生素的培養(yǎng)基上,抗生素包括頭孢噻吩(CF)、磺胺甲VA唑(SMZ)、諾氟沙星(NOR)、慶大霉素(GM),濃度分別為最小抑菌濃度(MIC)、1/2最小抑菌濃度(1/2MIC),過夜培養(yǎng)18h-24h后,挑取板上的單克隆,進(jìn)行菌落PCR擴增耐藥相關(guān)序列T2G6(本課題組前期研究篩選的位于質(zhì)粒上的耐藥相關(guān)序列之一),以篩選陽性克隆。 2質(zhì)粒提取：將陽性克隆挑至含NOR的LB液體培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng),通過離心收集菌體,進(jìn)而使用Axygen生物公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒,然后在O.5%的瓊脂糖凝膠上與原質(zhì)粒進(jìn)行電泳比對。 3藥物敏感試驗：以紙片法抗菌藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)及美國國立臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)指南為參照,采用Kin-Bauer:紙片瓊脂擴散法進(jìn)行藥敏鑒定,抗生素藥敏紙片包括：頭孢噻吩(CF)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢呋辛鈉(CXM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶／克拉維酸(CAZL)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTXL)、頭孢唑肟(ZOX)、頭孢哌酮(CFP)、氨曲南(AZT)、磺胺甲惡唑(SMZ)、甲氧芐啶(TMP)、諾氟沙星(NOR)、阿莫西林(AMX)、氨芐西林(AMP)、氯霉素(CHL)、四環(huán)素(TET)、鏈霉素(STR)、慶大霉素(GM)、亞胺培南(IPM)等。所用質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922. 4耐藥基因篩選：根據(jù)藥敏結(jié)果參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計引物篩選質(zhì)粒上可能存在的耐藥相關(guān)基因：喹諾酮類耐藥相關(guān)基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qurS、 qepA、aac(6')-Ib-cr,頭孢菌素類耐藥相關(guān)基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、 Ampc,磺胺耐藥基因sull及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat等的引物,PCR相關(guān)基因,并將獲得的PCR產(chǎn)物送至生物公司測序鑒定,經(jīng)BLAST比對后對基因進(jìn)行確認(rèn)。 5耐藥相關(guān)的可移動遺傳元件的篩選：參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計引物篩選質(zhì)粒上可能存在的可移動遺傳元件相關(guān)基因,包括插入序列ISEcp1、IS26、IS903、ISCR1;整合酶基因intl1、intI2及intI3;接合質(zhì)粒遺傳標(biāo)記traA、trbC。PCR相關(guān)基因,并將獲得的PCR產(chǎn)物送至生物公司測序鑒定,經(jīng)BLAST比對后對基因進(jìn)行確認(rèn)。 結(jié)果 1質(zhì)粒鑒定：通過對抗生素培養(yǎng)板上的單克隆進(jìn)行菌落PCR耐藥相關(guān)序列T2G6,在含NOR(1/2MIC)I的LB固體培養(yǎng)基上獲得陽性克隆；質(zhì)粒凝膠電泳比對結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒即為所轉(zhuǎn)化的志賀菌屬細(xì)菌質(zhì)粒。 2藥敏鑒定：感受態(tài)大腸桿菌對所有的抗生素敏感,轉(zhuǎn)化子對CAZ、AZT耐藥,對CTX、ZOX中介耐藥,對其他抗生素則敏感。轉(zhuǎn)化子與感受態(tài)大腸桿菌相比：CTX、CFP、ZOX、FEP、NOR、CIP、LVF、SMZ、TMP、CHL的抑菌環(huán)直徑減小5mm以上；CFZ、CXM、AMP、AMX、GM、STR、TET、IPM抑菌環(huán)直徑的變化在5mm內(nèi)。ESBLs確證實驗表明該轉(zhuǎn)化子為非產(chǎn)ESBLs菌株。 3耐藥基因的篩選：該質(zhì)粒上存在耐藥基因TEM-116、sull及cat,未檢測到喹諾酮類抗生素耐藥相關(guān)基因。 4耐藥相關(guān)可移動遺傳元件的篩選：1類整合子酶基因檢測陽性：接合質(zhì)粒遺傳標(biāo)記trbC篩選陽性：未檢測到插入序列ISEcp1、IS26、IS903、ISCRl的存在 結(jié)論 1該質(zhì)粒為廣宿主接合質(zhì)粒,可介導(dǎo)大腸桿菌與志賀菌屬細(xì)菌間耐藥性的傳遞。 2該質(zhì)粒為多重耐藥質(zhì)粒,可介導(dǎo)細(xì)菌對頭孢類抗生素及單環(huán)內(nèi)酰類抗生素耐藥；與喹諾酮類抗生素、氯霉素、磺胺類等抗生素耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。 3該質(zhì)粒上所含有的耐藥基因及耐藥相關(guān)的可移動元件不能完全解釋其耐藥表型,其作用機制有待深入研究。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2439416