發(fā)布時間：2019-03-02 17:37

【摘要】：背景：布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病)又稱地中海弛張熱,馬耳他熱,波浪熱或波狀熱,是由布魯氏菌(Brucella,簡稱布菌)侵入機(jī)體后引起的人畜共患傳染病。人感染后可引發(fā)關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎等,表現(xiàn)為持續(xù)性感染且難以治愈。動物感染后可引發(fā)公畜睪丸炎和附睪炎,孕畜多數(shù)發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等,是造成畜牧業(yè)重大損失的主要疾病之一。近年來,該病的發(fā)生和流行在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計表明,全球每年有50萬例人布病發(fā)生,每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億美元。根據(jù)我國疾病預(yù)防控制中心(CDC)的統(tǒng)計顯示,我國每年也有35000例人布菌感染病例。 布菌為革蘭氏陰性,兼性厭氧胞內(nèi)寄生菌,無芽胞,無鞭毛,有莢膜。目前布魯氏菌科可分為9個種屬：羊種(B. melitensis),牛種(B. abortus),豬種(B.suis),沙林鼠種(B. neotomae),綿羊附睪種(B. ovis),犬種(B. canis),田鼠種(B.microti),鯨型海洋種(B. ceti)和鰭型海洋種(B. pinnipedialis)。我國流行的布病總體上以羊種為主的混合感染,羊種占流行株的85%。布病的預(yù)防主要依賴疫苗免疫,減毒活疫苗是目前最為有效的疫苗。羊種布菌疫苗M5-90是我國自主研發(fā)用于預(yù)防綿羊和山羊的減毒活疫苗,免疫效果比較好。然而,M5-90疫苗株也存在兩個缺陷：一是免疫動物與自然感染動物不能區(qū)別,嚴(yán)重影響了布病的診斷和檢疫；二是疫苗毒力較強(qiáng),可引起部分孕畜流產(chǎn)。因此,研制一種新型的毒力低、免疫效果好、能進(jìn)行鑒別診斷的分子標(biāo)記疫苗勢在必行。 目前,國內(nèi)外傾向于采用基因工程的手段對布菌現(xiàn)有疫苗進(jìn)行改造。國外曾有研究報道了羊種布菌疫苗株Rev.1BP26基因缺失株(CGV26)并發(fā)現(xiàn)仍具有免疫保護(hù)效果。但是,國內(nèi)研究人員對M5-90菌株進(jìn)行改造,敲除BP26得到新的突變株M5Δbp26,其毒力有所下降,但免疫應(yīng)答弱于原疫苗株,持續(xù)時間短,免疫效果達(dá)不到要求。由此推斷,BP26蛋白可能與疫苗株毒力和保護(hù)性抗原相關(guān),若將M5-90疫苗株攜帶的BP26基因全部敲除,則影響弱毒疫苗株的免疫效果。 膜間質(zhì)蛋白或稱周質(zhì)蛋白BP26(Periplasmic Protein BP26),又稱omp28或CP28是布菌的一種外膜間質(zhì)蛋白,在布菌多數(shù)亞種中具有高度的保守性。研究表明,BP26蛋白在感染的牛、綿羊、山羊和人中是一種免疫優(yōu)勢抗原,可作為動物和人布菌感染的診斷抗原,準(zhǔn)確率可達(dá)到86%以上。因此,我們設(shè)想在保留M5-90BP26蛋白的保護(hù)性抗原表位前提下,針對BP26蛋白抗原表位及毒力相關(guān)位點(diǎn)進(jìn)行分子修飾或改造,構(gòu)建分子標(biāo)記的弱毒疫苗株,建立表位Peptide-ELISA診斷方法,進(jìn)而解決布魯氏菌疫苗免疫與野生菌株感染的鑒別診斷技術(shù)難題。 目的：本研究旨在揭示布菌弱菌毒株B. melitensis M5-90的BP26蛋白B和T細(xì)胞抗原表位,最終繪制出M5-90主要蛋白抗原表位及其宿主MHC限制性圖譜,為M5-90弱毒疫苗株的基因工程改造提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。 材料與方法：實(shí)驗(yàn)采用基因原核表達(dá)技術(shù),制備M5-90重組BP26(rBP26)蛋白。以rBP26蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠,采用鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備BP26單克隆抗體。以M5-90菌株提取的含天然BP26的膜蛋白(NMP)為抗原,采用West Blot和ELISA方法測定制備的單克隆抗體的特性；以合成的BP26重疊多肽或突變多肽,采用Peptide-ELISA方法篩查和鑒定單克隆抗體識別的抗原表位。以M5-90免疫羊和疫區(qū)羊血清樣品,測定篩查出的BP26表位多肽與抗體的反應(yīng)性,評價與rBP26-ELISA、NMP-ELISA以及常規(guī)試管凝集試驗(yàn)(SAT)和虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)的符合率。采用ELISPOT方法,測定BP26多肽誘導(dǎo)免疫綿羊PBMCs表達(dá)特異性IFN-y的水平,初步篩查BP26蛋白T細(xì)胞抗原表位。 結(jié)果： 1.重組BP26蛋白。實(shí)驗(yàn)以pET-28a或pET-30a質(zhì)粒構(gòu)建了1個表達(dá)完整的rBP26(1-250aa)、3個表達(dá)截短的rBP26-1(29-250aa)、rBP26-2(48-131aa)和rBP26-3(129-250aa)的重組載體,并在大腸桿菌中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)超聲破碎細(xì)菌后的表達(dá)蛋白產(chǎn)物包涵體以鹽酸胍溶解、復(fù)性和純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定純度在80%以上。 2.BP26單克隆抗體。用復(fù)性的rBP26抗原分三次免疫BALB/c小鼠,抗原量分別為100μg、50μg、25μg,效價達(dá)1：102400。選擇免疫效價高的小鼠,無菌取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合。經(jīng)過一輪亞克隆及3-4輪克隆化對雜交瘤細(xì)胞篩選,共獲得29株抗rBP26蛋白單克隆抗體(mAb),其中18株IgG1(k)、1株IgG2a(k)、8株IgG2b(k)、1株IgG3(k)和1株IgA(k)。應(yīng)用疫苗株M5-90膜蛋白提取物(NMP),對29株單抗進(jìn)行了Western-blot和Dot-ELISA進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,19株單抗在Western-blot檢測時,能與變性的含天然BP26的膜蛋白提取物(NMP)反應(yīng)；16株單抗在Dot-ELISA檢測時,能與非變性的天然BP26蛋白反應(yīng)；2株單抗僅與rBP26反應(yīng)而與NMP不反應(yīng)。另外,以28個BP26重疊多肽測定,11株單抗與合成多肽反應(yīng)。根據(jù)識別BP26抗原的性質(zhì),將29株單抗識別的BP26抗原表位分為線型(11株)、構(gòu)象型(8株)、半構(gòu)象型(8株)及未分類(2株)四個類型。 3.B細(xì)胞線性抗原表位。應(yīng)用合成的28條重疊多肽(命名為P01-P28,長度11-16個氨基酸,重疊7個氨基酸,覆蓋完整BP26蛋白),分別與制備的29株單抗進(jìn)行Peptide-ELISA測定。結(jié)果顯示,其中11株單抗能與3條命名為P11、P12和P13的多肽反應(yīng)。根據(jù)與多肽的反應(yīng),將11株單抗分為三個組：第一組,與多肽P11反應(yīng)的為3D7、3H5和4D9；第二組,與多肽P12反應(yīng)的為2A4、2H9、3H6和5F12；第三組,與多肽P12和P13反應(yīng)的為5A5、1G1、5812和7C6。分析判定,P11中包含一個抗原表位,P12和P13兩者共同包含一個抗原表位。為了進(jìn)一步區(qū)別P12與P11攜帶的表位,實(shí)驗(yàn)合成了P12’(102-117aa)多肽,去掉了P12中與P11重疊氨基酸。為了進(jìn)一步精確測定抗原表位,針對P11和P12’各合成了各6條9個氨基酸的重疊短肽(分別命名為P1101-P1106或P1201-P1206,重疊8個氨基酸)。從三個組別中分別挑選出一株單抗即3H5、2A4和5A5,以競爭抑制ELISA方法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示短肽P1104能夠抑制單抗3H5與多肽P11反應(yīng),P1202、P1203和P1204能夠抑制單抗2A4與多肽P12’反應(yīng),而P1202-P1206均能抑制單抗5A5與多肽P12’反應(yīng),但是P1203與P1204抑制能力明顯強(qiáng)于P1202、P1205和P1206。所以,3H5單抗識別的抗原表位核心為93DRDLQTGGI101,2A4和5A5單抗識別同一個抗原表位核心為104QPIYVYPD111在P11和P12’兩個表位多肽內(nèi)各選擇了兩個位點(diǎn)進(jìn)行了氨基酸突變,合成了點(diǎn)突變多肽MutP11(D93N和D95N)與MutP12'(Y107F和Y109F)。將突變多肽分別與11株單抗進(jìn)行Peptide-ELISA反應(yīng),結(jié)果顯示,除2H9及5F12外,9株單抗與突變多肽的反應(yīng)能力明顯減弱或喪失,說明P11或P12’中確實(shí)分別包含了一個抗原表位,且突變的位點(diǎn)是構(gòu)成表位的關(guān)鍵氨基酸。 4.B細(xì)胞半構(gòu)象型和構(gòu)象型抗原表位區(qū)域。為了確定16株單抗識別的半構(gòu)象型和構(gòu)象型抗原表位的區(qū)域,采用構(gòu)建的3個截短的rBP26-1(29-250aa)、 rBP26-2(48-131aa)和rBP26-3(129-250aa)重組蛋白,進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果顯示,16株單抗均能與BP26蛋白的29-250aa大片段反應(yīng),無表位分布在前1-28aa的信號肽部位,5株單抗識別48-131aa區(qū)域,1株單抗識別129-250aa區(qū)域,1株單抗可識別兩個小片段蛋白。 5.B細(xì)胞線性抗原表位多肽與羊血清樣品的反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)測定了BP26兩條線性表位多肽,即93DRDLQTGGI101和104QPIYVYPD111的KLH偶聯(lián)物,與137份羊血清抗體(117份疫區(qū)隨機(jī)血清,20份免疫血清)的反應(yīng)性。采用常規(guī)布病診斷方法試管凝集試驗(yàn)(SAT)和虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)為對照,以ELISA方法測定P11-KLH、P12'-KLH、rBP26及NMP對羊血清的反應(yīng)。通過分析4種抗原抗體反應(yīng)結(jié)果與常規(guī)方法(金標(biāo)準(zhǔn))的符合率,繪制了ROC曲線并確立最優(yōu)Cutoff值,評價了發(fā)現(xiàn)的兩個線性表位多肽在布菌感染或疫苗免疫中的抗原反應(yīng)性。P11-KLH、P12'-KLH兩個表位多肽與常規(guī)法檢測結(jié)果的符合率分別為65%及70%,是布菌的兩個優(yōu)勢抗原表位。 6.T細(xì)胞抗原表位。以植物血凝素(PHA)或刀豆蛋白A (ConA)誘導(dǎo)PBMCs作為陽性對照,以不加多肽刺激物和加入非相關(guān)多肽刺激物的PBMCs作為陰性對照,采用ELISPOT方法測定BP26多肽誘導(dǎo)M5-90免疫羊表達(dá)特異性IFN-γ的水平。以陰性對照的平均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性判定的標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)初步篩選出了5個多肽表位能夠誘導(dǎo)較高水平的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng),分別為15TIMLVGAFSLPAFAQE30,42VTGEGMMTASPDMAIL57,69REAMTANN EAMTKVLD84,105PIYVYPDDKNNLKEPT120和195LGRVVEISELSRPPMP210。 結(jié)論： 1、制備了27株可與B.melitensis M5-90弱毒疫苗株BP26天然抗原反應(yīng)的鼠源單克隆抗體,其識別表位分為線型、半構(gòu)象型和構(gòu)象型三類。 2、發(fā)現(xiàn)2個BP26B細(xì)胞線性抗原表位,分別為93DRDLQTGGI101和104QPIYVYPD111,并證實(shí)是B. melitensis感染或疫苗免疫的優(yōu)勢抗原表位。 3、初步揭示了5個BP26特異性T細(xì)胞抗原表位,分別為15TIMLVGAFSLPAFAQE30,42VTGEGMMTASPDMAIL57,69REAMTANNEAMTK VLD84,105PIYVYPDDKNNLKEPT120和195LGRVVEISELSRPPMP210,可以特異性誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IFN-γ。 4、研究結(jié)果為指導(dǎo)M5-90弱毒菌苗株的基因工程改造提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

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本文編號：2433298