【摘要】：蟾酥是由蟾蜍科兩棲爬行動(dòng)物的耳后腺及皮膚腺分泌物經(jīng)加工干燥制成,為傳統(tǒng)中藥材。蟾酥所含甾體類、生物堿等生物活性物質(zhì)因具有強(qiáng)心、升壓、興奮中樞、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種功能而被廣泛應(yīng)用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞膜上富含多種離子通道,它們的結(jié)構(gòu)和功能是決定神經(jīng)元興奮性及相關(guān)生命過(guò)程的分子基礎(chǔ)。 本研究旨在檢測(cè)蟾酥活性成分蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元興奮性的影響,以及其對(duì)延遲整流型鉀通道的作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下： (1)檢測(cè)了兩種蟾酥二烯內(nèi)酯類化合物脂蟾毒配基(Resibufogenin, RBG)和華蟾酥毒基(Cinobufagin, CBG)對(duì)于對(duì)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元興奮性的影響,以及它們對(duì)決定動(dòng)作電位的電壓依賴性鈉、鉀、鈣通道的影響。 對(duì)動(dòng)作電位波形參數(shù)的作用結(jié)果顯示,胞外給予RBG/CBG,能夠增加動(dòng)作電位的峰值和超射值,顯著降低動(dòng)作電位的基強(qiáng)度、動(dòng)作電位閾值和半峰時(shí)程。對(duì)重復(fù)放電動(dòng)作電位的作用結(jié)果顯示,細(xì)胞外RBG/CBG的調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)先增強(qiáng)后抑制的趨勢(shì),在短時(shí)間內(nèi)可以提高神經(jīng)元興奮性,明顯增加細(xì)胞重復(fù)放電產(chǎn)生的第一個(gè)動(dòng)作電位的動(dòng)作電位峰值,降低激活閾值；長(zhǎng)時(shí)間作用反而抑制神經(jīng)元興奮性,表現(xiàn)為重復(fù)放電過(guò)程中后續(xù)動(dòng)作電位峰值降低,膜電位提高,放電頻率降低等。細(xì)胞外給予1μMRBG/CBG對(duì)電壓門控鈉通道電流有激活作用,明顯抑制電壓門控鉀通道電流,對(duì)電壓門控鈣通道電流無(wú)顯著影響。 (2)應(yīng)用全細(xì)胞和單通道膜片鉗技術(shù),研究了RBG/CBG對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞上的瞬時(shí)外向鉀電流(IA)和延遲整流鉀電流(IK)的調(diào)節(jié)作用。 RBG在細(xì)胞外濃度依賴性的抑制IA及IK的幅度,并且該作用具有電壓依賴性。同時(shí),RBG對(duì)IK的激活和失活的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也有顯著影響,使IK電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線右移,穩(wěn)態(tài)失活曲線左移；RBG對(duì)IA的激活過(guò)程并無(wú)顯著影響,卻可以顯著其影響失活過(guò)程,使穩(wěn)態(tài)失活曲線向電壓的超極化方向移動(dòng)。細(xì)胞外給予相同濃度的CBG后,對(duì)IK的作用效果與RBG相似。CBG可以濃度依賴性的抑制IK的幅度,并且具有電壓依賴性；對(duì)IK的穩(wěn)態(tài)激活和失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)也有顯著影響,使電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線右移,穩(wěn)態(tài)失活曲線左移；但是細(xì)胞外給予不同濃度的CBG對(duì)IA卻沒(méi)有顯著影響。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)胞內(nèi)給予1μM RBG/CBG,在不影響通道的電流幅度和電導(dǎo)的情況下,可以影響通道的開放頻率,開放時(shí)間和關(guān)閉時(shí)間等通道動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 (3)使用Autodock軟件計(jì)算強(qiáng)心苷母核和多種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物與哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的延遲整流型鉀通道亞型Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1的相互作用。 以Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1為受體,以RBG/CBG等12種蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物及強(qiáng)心苷母核作為配體,使用Autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn),預(yù)測(cè)了藥物與通道蛋白的對(duì)接區(qū)域。對(duì)接結(jié)果顯示：12種藥物的盲對(duì)接結(jié)果呈現(xiàn)了較高的一致性,進(jìn)一步的對(duì)接計(jì)算說(shuō)明盲對(duì)接結(jié)果可信,由此確定了受體與配體化合物的結(jié)合區(qū)域。對(duì)接結(jié)果還顯示出配體母核在對(duì)接過(guò)程中起著重要的作用,配體與受體的結(jié)合是極化作用和疏水鍵作用雙重作用的結(jié)果。蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物與Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1相互作用活性位點(diǎn)的理論預(yù)測(cè)將有助于該藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)控興奮性機(jī)制的研究。 (4)采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染野生型和突變型Kv2.1鉀通道質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞為細(xì)胞模型,應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察和記錄了RBG對(duì)野生型和突變型Kv2.1鉀通道電流的影響及其調(diào)控作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)在Kv2.1鉀通道電流無(wú)明顯衰減的條件下進(jìn)行。RBG可以呈濃度依賴性的抑制Kv2.1鉀電流；其抑制Kv2.1鉀通道的IC50值為1.17gM；當(dāng)去極化至+70mV時(shí),1μMRBG可以將Kv2.1電流抑制達(dá)對(duì)照組的55.29±7.01%；10μM RBG對(duì)Kv2.1鉀通道的抑制效果接近最大。以TEA為陽(yáng)性對(duì)照藥物,1μM RBG和10mM TEA對(duì)Kv2.1鉀電流的抑制程度接近。RBG可以加速Kv2.1通道穩(wěn)態(tài)激活和失活過(guò)程,增加TEA對(duì)Kv2.1通道電流的阻斷作用,而且這種影響在細(xì)胞內(nèi)外液缺少K+的情況下仍然存在。敲除Kv2.1的C末端,可以去除RBG對(duì)Kv2.1通道的調(diào)節(jié)作用。對(duì)于突變型Kv2.1(?)C416,RBG對(duì)野生型Kv2.1通道的抑制作用,以及對(duì)Kv2.1通道穩(wěn)態(tài)激活和失活特征的影響都消失。提示在Kv2.1(?)C416和Kv2.1(?)C318之間的氨基酸序列是決定RBG與Kv2.1通道結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。 綜上所述,本文利用電生理等檢測(cè)方法在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上考察了蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物對(duì)神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)作用；利用12種結(jié)構(gòu)相似的蟾蜍甾二烯類化合物與Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1兩種受體蛋白進(jìn)行了分子對(duì)接研究,得到這些藥物分子與通道蛋白相互作用的活性區(qū)域；利用轉(zhuǎn)染Kv2.1的HEK293細(xì)胞考察了藥物對(duì)電壓依賴型鉀通道的影響,并闡述了藥物對(duì)該類型通道的作用機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R338

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2426589