發(fā)布時間：2019-02-19 14:30

【摘要】：蟾酥是由蟾蜍科兩棲爬行動物的耳后腺及皮膚腺分泌物經加工干燥制成,為傳統(tǒng)中藥材。蟾酥所含甾體類、生物堿等生物活性物質因具有強心、升壓、興奮中樞、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種功能而被廣泛應用。中樞神經系統(tǒng)神經元細胞膜上富含多種離子通道,它們的結構和功能是決定神經元興奮性及相關生命過程的分子基礎。 本研究旨在檢測蟾酥活性成分蟾蜍二烯內酯類化合物對中樞神經系統(tǒng)神經元興奮性的影響,以及其對延遲整流型鉀通道的作用機制。主要研究內容與結果如下： (1)檢測了兩種蟾酥二烯內酯類化合物脂蟾毒配基(Resibufogenin, RBG)和華蟾酥毒基(Cinobufagin, CBG)對于對原代培養(yǎng)的海馬神經元興奮性的影響,以及它們對決定動作電位的電壓依賴性鈉、鉀、鈣通道的影響。 對動作電位波形參數的作用結果顯示,胞外給予RBG/CBG,能夠增加動作電位的峰值和超射值,顯著降低動作電位的基強度、動作電位閾值和半峰時程。對重復放電動作電位的作用結果顯示,細胞外RBG/CBG的調節(jié)作用呈現先增強后抑制的趨勢,在短時間內可以提高神經元興奮性,明顯增加細胞重復放電產生的第一個動作電位的動作電位峰值,降低激活閾值；長時間作用反而抑制神經元興奮性,表現為重復放電過程中后續(xù)動作電位峰值降低,膜電位提高,放電頻率降低等。細胞外給予1μMRBG/CBG對電壓門控鈉通道電流有激活作用,明顯抑制電壓門控鉀通道電流,對電壓門控鈣通道電流無顯著影響。 (2)應用全細胞和單通道膜片鉗技術,研究了RBG/CBG對原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經元細胞上的瞬時外向鉀電流(IA)和延遲整流鉀電流(IK)的調節(jié)作用。 RBG在細胞外濃度依賴性的抑制IA及IK的幅度,并且該作用具有電壓依賴性。同時,RBG對IK的激活和失活的動力學參數也有顯著影響,使IK電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線右移,穩(wěn)態(tài)失活曲線左移；RBG對IA的激活過程并無顯著影響,卻可以顯著其影響失活過程,使穩(wěn)態(tài)失活曲線向電壓的超極化方向移動。細胞外給予相同濃度的CBG后,對IK的作用效果與RBG相似。CBG可以濃度依賴性的抑制IK的幅度,并且具有電壓依賴性；對IK的穩(wěn)態(tài)激活和失活動力學參數也有顯著影響,使電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線右移,穩(wěn)態(tài)失活曲線左移；但是細胞外給予不同濃度的CBG對IA卻沒有顯著影響。進一步的實驗結果表明,細胞內給予1μM RBG/CBG,在不影響通道的電流幅度和電導的情況下,可以影響通道的開放頻率,開放時間和關閉時間等通道動力學參數。 (3)使用Autodock軟件計算強心苷母核和多種蟾蜍二烯內酯類化合物與哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中主要的延遲整流型鉀通道亞型Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1的相互作用。 以Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1為受體,以RBG/CBG等12種蟾蜍二烯內酯類化合物及強心苷母核作為配體,使用Autodock軟件進行分子對接實驗,預測了藥物與通道蛋白的對接區(qū)域。對接結果顯示：12種藥物的盲對接結果呈現了較高的一致性,進一步的對接計算說明盲對接結果可信,由此確定了受體與配體化合物的結合區(qū)域。對接結果還顯示出配體母核在對接過程中起著重要的作用,配體與受體的結合是極化作用和疏水鍵作用雙重作用的結果。蟾蜍二烯內酯類化合物與Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1相互作用活性位點的理論預測將有助于該藥物在中樞神經系統(tǒng)中調控興奮性機制的研究。 (4)采用瞬時轉染野生型和突變型Kv2.1鉀通道質粒的HEK293細胞為細胞模型,應用全細胞膜片鉗技術觀察和記錄了RBG對野生型和突變型Kv2.1鉀通道電流的影響及其調控作用機制。 實驗在Kv2.1鉀通道電流無明顯衰減的條件下進行。RBG可以呈濃度依賴性的抑制Kv2.1鉀電流；其抑制Kv2.1鉀通道的IC50值為1.17gM；當去極化至+70mV時,1μMRBG可以將Kv2.1電流抑制達對照組的55.29±7.01%；10μM RBG對Kv2.1鉀通道的抑制效果接近最大。以TEA為陽性對照藥物,1μM RBG和10mM TEA對Kv2.1鉀電流的抑制程度接近。RBG可以加速Kv2.1通道穩(wěn)態(tài)激活和失活過程,增加TEA對Kv2.1通道電流的阻斷作用,而且這種影響在細胞內外液缺少K+的情況下仍然存在。敲除Kv2.1的C末端,可以去除RBG對Kv2.1通道的調節(jié)作用。對于突變型Kv2.1(?)C416,RBG對野生型Kv2.1通道的抑制作用,以及對Kv2.1通道穩(wěn)態(tài)激活和失活特征的影響都消失。提示在Kv2.1(?)C416和Kv2.1(?)C318之間的氨基酸序列是決定RBG與Kv2.1通道結合的關鍵區(qū)域。 綜上所述,本文利用電生理等檢測方法在原代培養(yǎng)的海馬神經元上考察了蟾蜍二烯內酯類化合物對神經元興奮性的調節(jié)作用；利用12種結構相似的蟾蜍甾二烯類化合物與Kv1.2和Kv1.2-Kv2.1兩種受體蛋白進行了分子對接研究,得到這些藥物分子與通道蛋白相互作用的活性區(qū)域；利用轉染Kv2.1的HEK293細胞考察了藥物對電壓依賴型鉀通道的影響,并闡述了藥物對該類型通道的作用機制。
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【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R338

【參考文獻】

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本文編號：2426589