【摘要】：剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是人畜共患細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲。免疫功能正常的機(jī)體感染弓形蟲，絕大多數(shù)表現(xiàn)為隱性感染，但孕婦、嬰幼兒和免疫抑制者感染后，則分別可能導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎或急性獲得性弓形蟲病，死亡率甚高，危害嚴(yán)重。弓形蟲蟲體侵入宿主細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，排泄分泌大量抗原性物質(zhì)，即弓形蟲ESA（excreted-secreted antigens），參與引起宿主損傷和免疫反應(yīng)。 作為一種重要的機(jī)會(huì)性致病原蟲，弓形蟲的致病作用與蟲株毒力、宿主免疫狀態(tài)密切相關(guān)。據(jù)侵襲力、繁殖速度、致死率、包囊形成與否等的不同，剛地弓形蟲可分為強(qiáng)毒株系和弱毒株系。強(qiáng)毒株以RH株為代表，對(duì)常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠都極為敏感，感染后速殖子在體內(nèi)可迅速增殖，引起急性的致死性感染，3-5天即死亡。弱毒株P(guān)RU株則為成囊株，感染包囊后的小鼠平均在一周后發(fā)病，數(shù)周后才出現(xiàn)死亡或形成長(zhǎng)期慢性感染。 弓形蟲感染宿主后的結(jié)果取決于宿主與蟲體間的相互作用。宿主方面，，細(xì)胞免疫一直被認(rèn)為是機(jī)體抵抗弓形蟲感染保護(hù)性免疫的基礎(chǔ)，在抑制蟲體繁殖、清除蟲體、控制蟲血癥方面起重要作用。近年來，隨著一群具有抑制功能的CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與深入研究，越來越多的證據(jù)表明此群細(xì)胞在調(diào)節(jié)病原體感染免疫中起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)它們可以在一定程度上通過影響感染部位免疫應(yīng)答的敏感性來抑制過度的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致病原體的長(zhǎng)期存在。 本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲RH株ESA腹腔接種孕鼠，同樣可以導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)，引起體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量上升及CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量下降。研究表明，ESA對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生的影響與弓形蟲感染所致的影響相似。然而目前為止有關(guān)這些蟲源性物質(zhì)對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的影響，研究還不深入。那么不同毒力株弓形蟲ESA對(duì)正常機(jī)體的免疫細(xì)胞影響是否會(huì)有不同？這些免疫細(xì)胞的狀態(tài)是否與不同毒力株感染后的結(jié)局有關(guān)聯(lián)？結(jié)合上述資料和問題，本研究旨在探討不同毒力株弓形蟲ESA對(duì)小鼠免疫細(xì)胞亞群的影響，觀察不同毒力株ESA對(duì)正常小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞、CD4~+CD25~+T細(xì)胞的影響，并初步探討其變化機(jī)制，為今后弓形蟲病的免疫預(yù)防和干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。 我們建立弓形蟲不同毒力株ESA處理小鼠模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠脾臟中NK細(xì)胞、CD4~+CD25~+T細(xì)胞數(shù)量比例變化。磁珠分選NK細(xì)胞，采用LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)YAC-1細(xì)胞的殺傷功能；采用RT-PCR方法檢測(cè)NK細(xì)胞中顆粒酶B表達(dá)水平。同時(shí)磁珠分選CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，3H-TdR摻入細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組脾臟CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制功能。采用ELISA檢測(cè)不同處理組小鼠血清IFN-γ的分泌水平等。 本研究獲得如下主要結(jié)果： 1.采用無血清體外培養(yǎng)的方法，成功制備RH株、PRU株ESA，經(jīng)BCA蛋白定量法測(cè)定，RH株ESA蛋白濃度為0.48mg/mL，PRU株ESA蛋白濃度為1.9mg/mL。為確定處理濃度，采用不同劑量RH株ESA注射小鼠，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同劑量RH株ESA處理小鼠，小鼠脾臟NK細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例與PBS對(duì)照組相比均有上升，在0.002mg的劑量下已出現(xiàn)較為明顯的上升，因此，我們采用0.002mg作為處理劑量建立小鼠模型，觀察各細(xì)胞亞群變化。 2.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠脾臟NK細(xì)胞數(shù)量比例增加。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同毒力株ESA處理小鼠，脾臟NK細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例較PBS對(duì)照組均上升，其中注射RH株ESA上升最明顯，與PRU株差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠血清IFN-γ分泌水平升高。ELISA結(jié)果顯示，不同毒力株ESA處理，小鼠血清IFN-γ分泌顯著高于對(duì)照組水平，其中RH株處理組高于PRU株處理組。 4.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠脾臟CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量比例降低。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，不同毒力株ESA處理小鼠，脾臟CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T占脾細(xì)胞的比例較PBS對(duì)照組均下降，其中注射RH株ESA下降最明顯，與PRU株差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠NK細(xì)胞殺傷功能增強(qiáng)。磁珠分選各處理組小鼠NK細(xì)胞，LDH法檢測(cè)結(jié)果顯示， ESA處理組小鼠脾臟的NK細(xì)胞較未處理NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞YAC-1細(xì)胞的功能增強(qiáng)，其中RH株ESA處理組殺傷能力強(qiáng)于PRU組。 6.不同毒力株ESA接種小鼠，小鼠CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制功能增強(qiáng)。磁珠分選各處理組小鼠CD4~+CD25~+T細(xì)胞，3H-TdR摻入法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗CD3的刺激下，ESA處理組小鼠脾臟的CD4~+CD25~+T細(xì)胞抑制CD4+CD25-T細(xì)胞增殖的能力較正常對(duì)照組明顯下降，其中RH株處理組抑制功能下降較PRU株處理組明顯。 7.磁珠分選正常小鼠NK細(xì)胞、CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，體外與不同毒力株ESA共培養(yǎng)，LDH法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)T細(xì)胞的特異性殺傷。結(jié)果顯示，不同毒力株ESA處理的小鼠NK細(xì)胞殺傷能力較對(duì)照組有明顯的升高，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RH株ESA處理組殺傷率強(qiáng)于PRU株處理組。 以上研究結(jié)果提示，NK細(xì)胞的數(shù)量與活性增加，CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少、抑制功能的增強(qiáng)在不同毒力株ESA致小鼠不同免疫應(yīng)答狀況中可能起到重要作用；不同毒力株ESA處理小鼠后，刺激NK細(xì)胞數(shù)量上升與功能增強(qiáng)的程度不同，引起CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少及抑制功能增強(qiáng)程度也不同。該結(jié)果可能部分解釋弓形蟲不同毒力株致病性的差別。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 趙俊桃;陳鳳鴻;陳錫慰;吳觀陵;;CD4~+CD25~+T調(diào)節(jié)細(xì)胞參與感染弓形蟲小鼠免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的研究[J];熱帶病與寄生蟲學(xué);2008年03期

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本文編號(hào)：2423449