【摘要】：淋巴管新生(lymphangiogenesis)與機(jī)體組織許多病理生理過程密切相關(guān),例如：惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移、免疫排斥反應(yīng)、創(chuàng)傷組織修復(fù)、炎癥、繼發(fā)性淋巴水腫等疾病。近些年來乳腺癌發(fā)病率不斷升高,乳腺癌手術(shù)清掃淋巴結(jié)、阻斷淋巴管引起的術(shù)后上肢淋巴水腫病例也隨之增多,對患者的生存質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。因此,研究淋巴管生成機(jī)制對于干預(yù)淋巴管生成、控制惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移、免疫排斥反應(yīng)或組織淋巴水腫等疾病的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等具有重要意義。單核細(xì)胞是外周血單個核細(xì)胞中重要的細(xì)胞群,在炎癥、腫瘤或免疫排斥反應(yīng)時可以在局部浸潤,分化為巨噬細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞,在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能和免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要的作用。近些年來研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞具有多向分化潛能,經(jīng)特定因子定向誘導(dǎo)可以分化成多種細(xì)胞,如上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)或血管內(nèi)皮細(xì)胞等。其中,體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為EPCs或血管內(nèi)皮樣細(xì)胞并用于血管新生的研究成為近些年來關(guān)注的熱點(diǎn)。對于EPCs參與血管新生機(jī)制方面的研究發(fā)現(xiàn),外周血單核細(xì)胞來源的EPCs表現(xiàn)低增殖能力,主要是通過以下方式參與血管新生：直接整合到血管壁；分泌血管內(nèi)皮生長因子、肝細(xì)胞生長因子、趨化因子等促進(jìn)血管新生。與單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、參與血管新生的研究相比,關(guān)于單核細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的研究尚少。目前的研究發(fā)現(xiàn),單核-巨噬細(xì)胞在炎癥、腫瘤或免疫排斥反應(yīng)等病理過程中浸潤到局部的數(shù)量與淋巴管生成的數(shù)量明顯相關(guān),甚至發(fā)現(xiàn)淋巴管壁有巨噬細(xì)胞的摻入,有文獻(xiàn)報道單核-巨噬細(xì)胞經(jīng)過活化后可以分泌淋巴管內(nèi)皮特異性生長因子VEGF-C等,因此認(rèn)為單核-巨噬細(xì)胞與淋巴管新生有密切聯(lián)系。然而,單核細(xì)胞能否轉(zhuǎn)分化為真正的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞?其轉(zhuǎn)分化條件或機(jī)制為何?尚缺乏足夠的科學(xué)證據(jù),有待于通過體外研究來證實。此外,我們前期的研究發(fā)現(xiàn),單核細(xì)胞在炎性細(xì)胞因子短期刺激下即可表達(dá)部分淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物。因此,本文假設(shè)單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和炎癥因子環(huán)境中可能被誘導(dǎo)分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,或通過分泌VEGF-C等因子來調(diào)控淋巴管新生。 目的：本研究旨在探討人外周血單核細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞生長因子以及炎癥因子誘導(dǎo)培養(yǎng)下是否能夠分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,及其對VEGF-C等因子的分泌情況,進(jìn)一步探討了單核細(xì)胞參與調(diào)控淋巴管新生的機(jī)制。該研究不僅對于揭示淋巴管新生的新的機(jī)制,而且對于進(jìn)一步將單核細(xì)胞用于干預(yù)淋巴管生成、控制淋巴管相關(guān)疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等具有重要的臨床應(yīng)用意義。 方法：用Ficoll密度梯度離心法從健康人外周血分離獲取單個核細(xì)胞,經(jīng)FN鋪板貼壁法獲取單核細(xì)胞,用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基EGM-2培養(yǎng)細(xì)胞,實驗組加入100ng/ml的LPS刺激細(xì)胞,分別用免疫細(xì)胞化學(xué),RT-PCR及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1、Prox-1以及內(nèi)皮細(xì)胞共同標(biāo)志物VEGFR-2、vWF、CD144的蛋白和基因的表達(dá)情況。同時還檢測了新鮮分離的單核細(xì)胞對干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、單核細(xì)胞標(biāo)志物CD14的表達(dá)情況,研究其向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化的可能性。收集細(xì)胞培養(yǎng)中的上清,采用ELISA法檢測上清中VEGF-C的含量,進(jìn)一步探討單核細(xì)胞參與調(diào)控淋巴管新生的機(jī)制。 結(jié)果：(1)新鮮分離的細(xì)胞：①免疫組化染色顯示細(xì)胞僅對CD14的蛋白表達(dá)為陽性。②RT-PCR結(jié)果顯示細(xì)胞僅表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VEGFR-3和LYVE-1。③流式檢測,結(jié)果顯示96.6%±0.7%的細(xì)胞為CD14陽性細(xì)胞；同時表達(dá)CD14和CD34的陽性率為0.9%±0.2%；同時表達(dá)CD14和VEGFR-3的陽性率為0.1%±0.1%；同時表達(dá)CD14和LYVE-1的陽性率為4.08%±0.3%；同時表達(dá)CD14和Podoplanin的陽性率為0.2%±0.1%。(2)經(jīng)EGM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)7d的細(xì)胞：①熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測顯示細(xì)胞對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1、Podoplanin、VEGFR-3以及內(nèi)皮細(xì)胞共同標(biāo)志物VEGFR-2、vWF的蛋白表達(dá)結(jié)果均呈陽性；②RT-PCR結(jié)果顯示,EGM-2誘導(dǎo)組細(xì)胞對VEGFR-3、Podoplanin、Prox-1、LYVE-1的m RNA的表達(dá)呈陽性；對vWF、CD144的表達(dá)呈陽性,對于VEGFR-2的mRNA表達(dá)則呈弱陽性或者陰性。EGM-2加LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞對上述標(biāo)記物的表達(dá)均為陽性,對于VEGFR-2的mRNA表達(dá)則呈弱陽性或陰性,與未加LPS刺激組細(xì)胞相比,細(xì)胞對淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物的表達(dá)強(qiáng)度有所升高。③流式結(jié)果顯示,EGM-2培養(yǎng)組細(xì)胞對VEGFR-3的表達(dá)率為1.5%±0.2%：LYVE-1的表達(dá)率為11.5±0.3%；Podoplanin的陽性率為1.6%±0.2%。加LPS誘導(dǎo)刺激的細(xì)胞對上述標(biāo)志物的表達(dá)明顯上調(diào)：對VEGFR-3的表達(dá)率為26.9%±0.7%；LYVE-1的表達(dá)率為73.6±0.3%；Podoplanin的陽性率為53.1%±0.5%。④ELISA檢測EGM-2誘導(dǎo)組細(xì)胞分泌VEGF-C的量為98.2(69.9-153.1)pg/106個細(xì)胞；EGM-2加LPS誘導(dǎo)培養(yǎng)組細(xì)胞分泌VEGF-C的量為211.4(179.8-437.8)pg/106個細(xì)胞。二者相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。 結(jié)論：①人外周血來源的單核細(xì)胞經(jīng)過FN以及EGM-2等的體外誘導(dǎo)培養(yǎng),細(xì)胞可以同時表達(dá)淋巴管內(nèi)皮特異性標(biāo)志物VEGFR-3、LYVE-1、Podoplanin、Prox-1以及內(nèi)皮共同標(biāo)志物vWF、CD144,而對于VEGFR-2的表達(dá)則為弱陽性或者陰性,認(rèn)為單核細(xì)胞可以分化為淋巴管內(nèi)皮樣細(xì)胞。②人外周血來源的單核細(xì)胞經(jīng)EGM-2誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞可以分泌VEGF-C,加LPS誘導(dǎo)刺激后分泌量明顯增加,認(rèn)為單核細(xì)胞分化成的淋巴管內(nèi)皮樣細(xì)胞可以通過旁分泌形式參與調(diào)控淋巴管新生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 謝飛;王鴻利;;血管性血友病因子研究進(jìn)展[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2006年07期

2 吳麗穎,王興鵬;阻斷內(nèi)毒素信號傳導(dǎo)通路治療膿毒癥或膿毒性休克的研究進(jìn)展[J];中華急診醫(yī)學(xué)雜志;2003年02期

3 張美華;王海杰;譚玉珍;劉銳;;人臍帶血淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化及其生物學(xué)特征[J];解剖學(xué)報;2006年04期

4 王長明;田鏵;梁艷紅;于偉;肖瓊;張肇林;;單核細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年11期

5 梁艷紅;張肇林;田鏵;王長明;王世坤;李鑫;宋濤;;單核細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的潛能(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年10期

6 范春玲,李燕,高平進(jìn),劉建軍,張學(xué)軍,朱鼎良;人臍血CD34~+內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外分化(英文)[J];Acta Pharmacologica Sinica;2003年03期

，

本文編號：2418142