【摘要】：一、研究背景和目的 腸出血型大腸埃希菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC)0157：H7是一種新現(xiàn)腸道傳染病致病菌,能引起出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic colitis, HC)、溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremic syndrome, HUS)和血栓性血小板減少性紫癜(Thrombotic thromobocytopenie porpura, TTP)等。1983年,Riley等首次報道了美國EHEC0157：H7引起的嚴重食源性疾病——出血性結(jié)腸炎。此后,由EHEC0157：H7引起的散發(fā)病例和小型暴發(fā)在世界范圍內(nèi)不斷發(fā)生。1986年,我國首次從出血性結(jié)腸炎患者中分離到EHEC0157：H7,已有十余個省份從食品、家畜家禽和腹瀉患者糞便中分離到該菌。目前,EHEC0157：H7的感染呈暴發(fā)流行趨勢,具有較強的傳染性與致病性,對人類健康構(gòu)成極大威脅,已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。 EHEC O157:H7的致病作用主要通過產(chǎn)：生志賀樣毒素(STX)和細菌對腸黏膜上皮細胞黏附-抹去損傷(attaching and effacing lesion, A/E損傷)完成。0157：H7能產(chǎn)生致死性志賀毒素(Stx),由前噬菌體上的slt基因編碼,是產(chǎn)Vero毒素大腸埃希菌(Vcrocytotoxin-producing E.coli,VTEC)區(qū)別于其它大腸桿菌的顯著特點。引起A/E損傷的主要毒力基因位于染色體腸細胞脫落位點(the locus of enterocyte effacement, LEE)毒力島。LEE毒力島由5個操縱子組成,編碼111型分泌系統(tǒng)(TTSS)、轉(zhuǎn)位蛋白(EspA, EspB, and EspD)、效應(yīng)蛋白(Tir, EspG, EspF, Map和lEspH)、緊密黏附素(intimin)、分子伴侶(CesAB, CesD, CesD2, CesF和CesT)和調(diào)控子(Ler, GrlA和GrlR)等。espF基因位于LEE4操縱子末端,編碼分泌效應(yīng)蛋白EspF (EHEC-secreted protein F)。目前,EHEC O157:H7感染致病的效應(yīng)蛋白已增加到20多種,其中EspF的作用范圍最廣,是多功能性的。腸致病型大腸埃希菌(Enteropathogenic E.coli, EPEC)的有關(guān)研究表明,EspF可與線粒體、核仁及細胞內(nèi)眾多蛋白分子結(jié)合,導(dǎo)致上皮細胞緊密連接破壞、微絨毛消失、細胞骨架重排、墊狀結(jié)構(gòu)(pedestal)形成,最終導(dǎo)致細胞凋亡。學(xué)術(shù)界認為,分泌蛋白EspF對于研究A/E病原體致病作用的分子機制舉足輕重,甚至將其稱為細菌性病原體致病的“瑞士軍刀”。 雖然,不同實驗室對EPEC中EspF蛋白在細胞特異性A/E損傷中的作用進行了深入研究,但是EHEC中EspF蛋白誘導(dǎo)宿主細胞凋亡的機制仍然不甚清楚,破壞腸上皮細胞緊密連接導(dǎo)致腸屏障功能喪失的動力學(xué)機制也不清楚。那么EHEC0157：H7中,EspF蛋白是否具有破壞細胞屏障功能,誘導(dǎo)細胞凋亡呢?EHEC0157：H7侵襲黏附宿主上皮細胞后是否影響腸上皮細胞緊密連接,導(dǎo)致腸粘膜改變或脫落而導(dǎo)致細胞黏附-抹去損傷?EspF蛋白哪個功能域在起作用呢? 本實驗的前期研究中,我們選取espF基因N端48-204bp序列作為敲除對象,采用重疊延伸PCR(OL-PCR)和同源重組技術(shù),成功構(gòu)建了espF基因N端缺失突變株EHEC O157:H7(ΔespF)。細菌黏附實驗和細胞毒性實驗表明,espF基因的缺失減弱了細菌對細胞的黏附能力和細胞毒性作用,但不影響細菌的生物學(xué)特性。本研究擬在已構(gòu)建的ΔespF突變株的基礎(chǔ)上,利用EHEC O157:H7野生型菌株和ΔespF突變株分別感染結(jié)腸癌Lovo細胞和BALB/c小鼠,采用免疫印跡法檢測感染細胞的Caspase家族凋亡蛋白酶-9/-3活性,采用TUNEL試驗法檢測體外感染細胞凋亡情況,比較EHEC野生型菌株和突變株感染后小鼠死亡率、結(jié)腸形態(tài)、結(jié)腸重量和結(jié)腸黏附細菌數(shù)量,熒光顯微鏡觀察結(jié)腸粘膜改變和細菌黏附情況。從蛋白分子、細胞水平和動物感染模型著手,揭示EspF蛋白在EHEC0157：H7導(dǎo)致腸上皮細胞黏附-抹去損傷過程中的細胞凋亡作用。 此外,本研究還采用PCR鑒定技術(shù)、細菌黏附性實驗和細胞LDH釋放實驗,對本實驗室收集的18株EHEC O157:H7流行菌株進行毒力鑒定,為后續(xù)EHEC致病機制研究篩選毒力菌株提供理論依據(jù)。 二、研究方法 1. EHEC O157:H7EspF蛋白導(dǎo)致細胞凋亡的研究 (1) Lovo細胞中Caspase-9/3凋亡蛋白檢測根據(jù)Western Blot實驗步驟,用EHEC O157:H7野生型菌株(WT)、espF基因缺失突變菌株(ΔespF)和放線菌素D(Act-D)分別處理Lovo細胞3h,激活Caspase家族蛋白酶-9/-3的活性。細胞裂解后提取蛋白,SDS-PAGE分離目的蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉,用Caspase-9抗體和Caspase-3抗體孵育過夜,HRP標(biāo)記的二抗孵育,ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色,凝膠成像儀檢測細胞凋亡蛋白分泌情況。同時設(shè)置空白對照組,選擇微管蛋白Tubulin作為內(nèi)參對照,調(diào)節(jié)各組樣本量。 (2) TUNEL細胞凋亡檢測EHEC O157:H7WT、ΔespF菌株和Act-D分別處理Lovo細胞3h,并設(shè)置空白對照組。PBS漂洗,樣品經(jīng)固定、封閉、通透后,TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒染色,DAPI復(fù)染,熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況并計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)。 (3)EHEC感染小鼠導(dǎo)致結(jié)腸A/E損傷的研究EHEC O157:H7WT、ΔespF和LB培養(yǎng)基分別灌胃接種BALB/c小鼠。第一批實驗小鼠感染后飼養(yǎng)20天,觀察小鼠生長和存活情況。另一批實驗小鼠于感染第七天處死,觀察結(jié)腸形態(tài)、水腫等病理特征,稱量結(jié)腸重量,涂板計數(shù)結(jié)腸黏附細菌數(shù)量。結(jié)腸經(jīng)4%多聚甲醛固定、30%蔗糖溶液脫水后制作冰凍切片,切片經(jīng)固定、通透后,用抗EHEC0157：H7抗體和羅丹明-鬼筆環(huán)肽進行染色,熒光顯微鏡下觀察結(jié)腸粘膜損傷和細菌黏附情況。 2. EHEC O157:H7流行菌株的毒力鑒定 根據(jù)E-hlyA,stx2,stxl基因序列設(shè)計引物,PCR檢測不同地區(qū)發(fā)生EHEC0157：H7暴發(fā)流行菌株的毒力基因；不同菌株感染Vero細胞3h,Giemsa染色觀察細菌對Vero細胞的黏附性；GENMED乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒檢測不同細菌作用細胞后釋放的LDH,通過計算LDH釋放率,比較不同菌株的細胞毒性作用強弱。 3.統(tǒng)計分析方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用SPSS13.0軟件,檢驗水準為α=0.05,P0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TUNEL陽性細胞計數(shù)和結(jié)腸重量采用單向方差分析(One-Way ANOVA),各組均數(shù)的多重比較(Multiple Comparisons)采用LSD法(Least-significant Difference,最小顯著差值法)；結(jié)腸黏附細菌計數(shù)采用獨立樣本t檢驗(Independent-Samples T test)；LDH釋放率采用獨立樣本非參數(shù)檢驗。三、結(jié)果 1.espF突變株導(dǎo)致細胞凋亡的能力比野生株低 Lovo細胞感染后,EHEC野生株誘導(dǎo)組(WT)可見Caspase-9和Caspase-3清晰蛋白條帶,說明Lovo細胞產(chǎn)生了Caspase-9/3凋亡蛋白,而espF基因缺陷突變株誘導(dǎo)組(ΔespF)Caspase-9/3蛋白條帶顏色比WT組淺,說明ΔespF感染細胞的凋亡蛋白表達水平低于WT組,但仍高于對照組。其次,各組的Caspase-3蛋白條帶顏色深于Caspase-9,說明感染細胞可能進入了凋亡后期。凋亡誘導(dǎo)劑放線菌素D(Act-D)處理組蛋白條帶顏色與WT組相仿,空白對照組也可見十分微弱的蛋白條帶。 TUNEL法檢測Lovo細胞凋亡情況,WT和Act-D感染細胞發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光,TUNEL陽性細胞數(shù)較多,說明細胞發(fā)生了較嚴重的凋亡；ΔespF組細胞綠色熒光較少,TUNEL陽性細胞數(shù)也少于WT組,表明其細胞凋亡程度輕于WT組。空白對照組細胞未發(fā)現(xiàn)綠色熒光,說明未感染細胞無或極少發(fā)生凋亡 2.espF突變株導(dǎo)致小鼠結(jié)腸A/E損傷程度比較野生株有所減輕 野生株組、突變株組和對照組小鼠經(jīng)相應(yīng)細菌感染后,WT組小鼠病死率為30%,較ΔespF組高,小鼠腸道發(fā)生水腫,固化糞便較少,是細菌引起的出血性結(jié)腸炎的典型表現(xiàn)；ΔespF組小鼠腸道較健康,帶有固化糞便,小鼠無死亡WT組感染小鼠結(jié)腸重量和黏附細菌數(shù)均高于ΔespF組小鼠。用小鼠抗EHEC0157：H7抗體和羅丹明鬼筆環(huán)肽,對結(jié)腸冰凍切片進行免疫熒光染色觀察,WT組結(jié)腸腸腔變大,粘膜微絨毛損傷或脫落,部分腸隱窩消失,粘膜上皮細胞表面和隱窩內(nèi)可見大量綠色熒光；ΔespF組結(jié)腸粘膜損傷不明顯,腸隱窩結(jié)構(gòu)較完整,細胞表面綠色熒光較少。說明WT組感染小鼠腸道粘膜損傷程度和黏附細菌數(shù)均高于ΔespF組感染小鼠。 3. EHEC O157:H7流行菌株的毒力不完全相同 PCR鑒定結(jié)果顯示,18株細菌中14株含溶血素E-hlyA基因,14株含stx2基因,只有8株含stxl基因。細胞黏附試驗和細胞毒性試驗發(fā)現(xiàn),所有EHEC菌株黏附能力和細胞毒性均強于對照組,而且stx2基因表達蛋白的毒力強于stxl基因表達蛋白的毒力。其中中國流行菌株882364、01H112和日本流行菌株Cua9的Vero細胞毒性與國際菌株933W/O的細胞毒性接近,明顯高于其他菌株。 四、結(jié)論 1. espF基因N端序列缺失,使細菌的黏附性、細胞毒性和誘導(dǎo)細胞凋亡能力降低,導(dǎo)致腸上皮細胞破壞和A/E損傷程度減輕。表明EspF蛋白是細菌感染引起細胞凋亡的重要毒力因子之一,在腸上皮細胞的細菌定植和啟動細胞凋亡程序中至關(guān)重要。證實N端為EspF蛋白的功能區(qū)。 2. EHEC不同菌株的毒力基因、細菌黏附力和Vero細胞毒性強弱不同,菌株882364、01H112、933W/O、Cua9毒力較強,為進一步的EHEC致病機制研究篩選出較為理想的強毒株。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

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本文編號：2416852