【摘要】：胚胎學研究顯示,在魚類、鳥類、兩棲類、哺乳類等脊椎動物的胚胎發(fā)育早期共同具有一段形態(tài)上非常類似的時期,即種系特征發(fā)育(phylotypic)階段�？茖W家們普遍認為,基因的表達調控決定著生物的性狀,追溯其外觀相似的生物本質,發(fā)現(xiàn)脊椎動物胚胎早期發(fā)育相關的蛋白往往直系同源、其編碼蛋白的基因也具有較高的保守性,并且這些發(fā)育相關基因側翼的調控序列也高度保守�；趯ι锉硇秃捅举|的認識,我們提出這樣一個設想,即脊椎動物的早期發(fā)育(種系特征發(fā)育階段)模式受到了某種保守性的(表觀)遺傳調控網(wǎng)絡的控制。 我們將在生物演化中具有高度保守性的調控序列作為研究這一保守的遺傳調控網(wǎng)絡的切入點。超保守元件(UCE)在人類基因組中成簇分布,位于關鍵性發(fā)育基因的側翼,部分UCE已被驗證在小鼠胚胎發(fā)育的特定組織中具有增強子活性。我們推測,這些保守的調控元件因為功能上的相關性或者相似性而發(fā)生相互作用,形成保守的(表觀)遺傳調控網(wǎng)絡。加之對細胞核區(qū)隔化結構及染色體空間結構或位置對基因調控產生的影響等方面認識的逐步深入,我們推測,保守的(表觀)遺傳調控網(wǎng)絡中的相關染色體很可能在細胞核空間發(fā)揮相互作用,并可能通過對染色體三維空間的相互作用進行捕獲的方法將此網(wǎng)絡抽提出來。于是,本研究基于對細胞核染色體空間結構的解析,挖掘并抽提這一保守的遺傳或表觀遺傳調控網(wǎng)絡,以加深對基因調控和生物演化發(fā)育機制的認識。 人類胚胎干細胞由于其分化的多潛能性,成為研究人類胚胎發(fā)育的良好模型。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了胚胎干細胞中具有的獨特基因表達模式:發(fā)育相關基因在胚胎干細胞中通常處于準備(poised)的狀態(tài),當細胞發(fā)生分化時,特異基因可以迅速啟動表達,決定細胞向不同組織器官分化的命運。同時,人類胚胎干細胞中還發(fā)現(xiàn)了一類成年特異組織中不具備的增強子元件,即準備型(poised)增強子元件(II類增強子),它們也與胚胎的早期發(fā)育密切相關�？梢�,胚胎干細胞中可能蘊藏著生物早期胚胎的發(fā)育模式,這些特點為利用人類胚胎干細胞模擬人類胚胎發(fā)育的研究提供了依據(jù)。 SOX2是胚胎干細胞中一個重要的轉錄因子,在胚胎干細胞多潛能性和未分化狀態(tài)維持中發(fā)揮著重要的功能。本研究從SOX2基因及其保守調控序列(SOX2 Bait)出發(fā),嘗試探討SOX2基因相關的染色體內部相互作用及染色體之間的相互作用與人類胚胎干細胞多潛能性間的聯(lián)系,為尋找胚胎干細胞多潛能相關保守(表觀)遺傳調控網(wǎng)絡提供了線索。本研究從以下幾個方面進行了探討: 建立了穩(wěn)定的人類胚胎干細胞大量培養(yǎng)方法和體系,通過優(yōu)化培養(yǎng)條件及機械傳代和胰酶消化傳代相結合的方法,在較短時間內獲得了質量穩(wěn)定的足夠細胞,為后續(xù)實驗提供了細胞材料;摸索了人類胚胎干細胞自主分化為EB細胞及定向誘導分化為神經(jīng)前體細胞(NPC)的實驗方法并獲得成功;關注人類胚胎干細胞向EB細胞分化過程中多潛能及分化相關基因的表達情況變化,發(fā)現(xiàn)了人類胚胎干細胞系H9在體外培養(yǎng)中的細胞異質性現(xiàn)象。 利用4C方法在全基因組范圍內篩選與SOX2 Bait相互作用的染色體片段。首先,通過體外構建質粒(pDNA)、模擬4C樣品的方法建立了4C-克隆篩選方法的質量控制標準。針對以SOX2 Bait為誘餌片段的4C擴增體系進行了PCR擴增條件優(yōu)化,初步驗證了該方法的有效性和可行性,為4C-有限克隆篩選和4C-seq樣品的制備提供了質量保證。 利用4C-有限克隆篩選方法對人類胚胎干細胞4C樣品(4C-DpnII)進行擴增和初步篩選,得到了SOX2基因座位內部的染色體相互作用片段。進一步利用3C方法檢測了這些相互作用片段在人類胚胎干細胞向EB細胞分化過程中相互作用頻率的改變,構建了SOX2基因局部染色體的三維構象變化模型,推測染色體空間結構改變與SOX2基因表達調控的關系。研究發(fā)現(xiàn),已報道增強子SRR1、SRR2與啟動子的相互作用隨著基因表達調控的改變而變化,這兩個增強子元件調控SOX2基因啟動子的模式在hESC和EB兩種不同類型細胞中具有顯著差異。Region011區(qū)域在EB3d和EB20d細胞中被檢測到與啟動子區(qū)具有相互作用,并在293A細胞中用熒光素酶報告基因的方法驗證了該區(qū)域的增強子活性,提示Region011有可能成為潛在的增強子元件,調控SOX2基因在分化的EB細胞中表達。 接著,利用4C-seq技術對以SOX2 Bait為誘餌片段的4C樣品(4C-DpnII)單輪PCR擴增產物(4C-Seq樣品)進行了Solexa高通量測序。篩選測序結果,將有效序列與人類基因組序列進行比對后,共得到135個位于不同基因組位置的命中序列(或命中片段)。這些命中序列分布于基因組中絕大多數(shù)染色體上,約有四分之一具有較好的保守性,同時具有p300和Elk-1的轉錄因子的結合位點,具有成為潛在增強子序列的可能。通過對命中序列相關基因功能的聚類分析(GO注釋),我們發(fā)現(xiàn)部分序列相關基因的功能與膜受體蛋白激酶活性、黃素單氧化酶活性、鈣離子結合等相關,在細胞黏附、生長等生物學過程中有一定的富集。并且,一些基因還參與了肺及生殖器發(fā)育等生物學過程,可能與SOX2在肺癌、卵巢癌和乳腺癌中的重要功能有一定關聯(lián)。其中16個基因與鈣離子的結合功能相關,與報道的SOX2在前列腺癌中的致瘤和抗凋亡機制似乎也存在某種聯(lián)系�？梢�,與SOX2 Bait相互作用的染色體片段在功能上可能與SOX2存在某種潛在聯(lián)系,通過對這些相互作用的檢測和功能分析,為抽提人類胚胎干細胞中SOX2基因相關保守(表觀)遺傳調控網(wǎng)絡構建了初步的框架。 利用3D-FISH實驗從單細胞水平上檢測并驗證染色體之間的相互作用。將改進后的3D-FISH方法用于檢測兩個待測基因染色體間的相互距離分布,并與對照組的基因間距離分布進行統(tǒng)計學分析,比較其顯著性差異,從而判定這兩個待測基因染色體在空間上是否相關。我們利用該方法在未分化的hESC和誘導分化的NPC兩種不同細胞類型中對4C-seq命中片段篩選到的4C-8/9(HMCN1基因內含子區(qū))片段與SOX2 Bait(SOX2基因增強子)染色體間的相互作用進行了檢測。結果證實,HMCN1與SOX2的相互作用是hESC特異的,并且在hESC向NPC的分化過程中該相互作用消失。HMCN1和SOX2基因不僅在生物學功能上均與眼睛的發(fā)育相關,而且通過對與SOX2 Bait發(fā)生相互作用的4C-8/9序列區(qū)域的組蛋白修飾情況的分析后發(fā)現(xiàn),4C-8/9區(qū)域具有HMCN1基因相關的潛在增強子的染色體修飾特點,并且與SOX2基因增強子同屬于人類胚胎干細胞中的II類準備(poised)型增強子,初步發(fā)現(xiàn)了人類胚胎干細胞中II類準備(poised)型增強子所在染色體在細胞核空間共定位的現(xiàn)象。實驗結果提示我們,相互作用序列可能由于調控類型的相似性或者功能上的相關性而在細胞核空間相互靠近,為“功能相關或相近片段在細胞核空間相共定位”的實驗假設提供了部分實驗證據(jù)。 最后,我們從機制和功能等方面進一步對細胞核中染色體片段空間共定位的現(xiàn)象進行了深入的討論。利用3D-FISH方法,我們檢測了位于hESC核心調控通路中3個多潛能性相關轉錄因子(Oct4、SOX2和Nanog)基因所在染色體的相對空間位置,發(fā)現(xiàn)Oct4和Nanog在空間上相互靠近;還檢測了4個同時具有9個轉錄因子結合的保守序列片段的相對空間位置,發(fā)現(xiàn)R1和C4在細胞核中相互靠近。我們發(fā)現(xiàn)了處于同一調控通路的功能相關并相互協(xié)調基因間存在相互作用及調控機制相關的保守性序列也可能在空間上相互靠近,從染色體相互作用的生物學意義和機制等方面初步驗證了“功能相關的保守序列在細胞核空間發(fā)生相互作用而形成網(wǎng)絡”的實驗假設。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻】

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1 田靖;趙志虎;陳惠鵬;;人類基因組中的保守非編碼元件[J];遺傳;2009年11期

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本文編號：2415951