【摘要】：背景與研究目的毛囊干細胞(Hair follicle stem cells,HFSCs)的發(fā)現(xiàn)及體外培養(yǎng),為研制新型組織工程皮膚治療在臨床上燒傷創(chuàng)傷導致的皮膚缺損,提供了新的思路和方法。目前研究認為HFSCs定位于毛囊外根鞘的隆突區(qū),大致是毛囊外根鞘最外層靠近立毛肌附著點處。HFSCs是具有多向分化潛能、自我復制、高度增殖能力等特點的多能干細胞,并且是分化為特定類型如表皮、毛囊和皮脂腺等的細胞來源。在維持毛囊周期以及組織形成過程中,HFSCs發(fā)揮重要作用。毛囊周期處于靜息狀態(tài)時,細胞呈慢周期性;在外來信號刺激下,則表現(xiàn)出很強的增殖潛能力和克隆形成能力,是上皮各類干細胞中最具增殖潛力的干細胞庫。本課題探討中采用酶消化法得到完整的毛囊,根據(jù)毛囊形態(tài)特征和解剖結構,在體外顯微分離毛囊隆突區(qū),成功地獲得高純度、有活性的人HFSCs,進行細胞原代和傳代培養(yǎng),為深入研究HFSCs生理功能及調節(jié)分化機制奠定了基礎。 研究表明,HFSCs的增殖分化受到自身基因及外來信號的共同作用。Wnt/β-catenin信號通路在毛囊毛發(fā)發(fā)育中起重要作用。在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中,Wnt蛋白與相應受體結合將啟動該信號途徑,引起β-catenin在胞漿內的堆積,隨之轉入到細胞核中,并與LEFl結合激活下游靶基因,促進毛囊干細胞定向分化。其他因素如化學物質(氯化鋰等)、細胞生長因子等眾多因素能使HFSCs胞漿內β-catenin水平改變,使HFSCs向著不同方向分化,但具體機制有待進一步研究。本課題探討以角質細胞生長因子(KGF)及氯化鋰(LiCl)干預下,Wnt/β-catenin信號通路在人HFSCs向毛囊乳突細胞或表皮細胞定向分化中的作用及與其他信號因子的相互關系,以及藥物控釋系統(tǒng)在組織工程皮膚中的應用。本實驗從以下幾個方面開展研究: 方法 1.采用酶消化法和顯微分離法獲取毛囊隆突區(qū)干細胞,進行原代培養(yǎng)。并以1×10~3/ml、1×10~4/ml、1×10~5/ml及1×10~6/ml接種密度體外培養(yǎng)人HFSCs,觀察細胞生長情況,用Hoechst方法檢測其生長曲線,觀察各密度培養(yǎng)的HFSCs在不同時間點的增殖效應;使用免疫熒光染色法對毛囊干細胞及其分化細胞進行鑒定。篩選出體外最佳的HFSCs傳代培養(yǎng)密度。 2.分別選用以0mmol/L、0.5mmol/L、1.5mmol/L、10mmol/L、25mmol/L的氯化鋰(LiCl)以及0ug/L、10ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L濃度梯度的角質細胞生長因子(KGF)誘導毛囊干細胞分化,Hoechst方法檢測對比分析各組對細胞增殖效應;探索促HFSCs分化的最佳LiCl及KGF濃度。使用RT-PCR檢測對照組、10mmol/ml LiCl組和10ug/L KGF組干預后3d、5d、7d、9d細胞的β-catenin、APC、GSK-3β、Axin和LEF1的mRNA水平,觀察轉錄水平情況,探討LiCl和KGF誘導HFSCs分化過程中,不同時間點的Wnt/β-catenin信號途徑及其相關信號因子的表達和相互作用。 3.PLGA納米微球在組織工程皮膚構建的實驗研究:制備PLGA納米微球,以擴增培養(yǎng)HFSCs為種子細胞,以載荷LiCl-PLGA及KGF-PLGA的脫細胞真皮(ADM)為支架材料,體外形成組織工程細胞皮片。對該膜片進行細胞活性染色及掃描電鏡觀察,評價該組織工程皮片,為動物實驗奠定良好基礎。 結果: 1.從人頭皮成功分離培養(yǎng)出HFSCs,在體外經(jīng)多次傳代后仍具有很強的增殖能力和多向分化潛能,當HFSCs接種密度為1×10~5ml時,細胞增殖速度最快,擴展能力強; 2.隨LiCl濃度升高,細胞增殖效應減弱,而KGF隨濃度增高增殖能力增強。含有LiCl的K-SFM條件培養(yǎng)基中HFSCs形態(tài)改變明顯,各組間有明顯差別,LiCl10mmol/L時分化比例高;而含有KGF的K-SFM條件培養(yǎng)基中HFSCs向表皮細胞分化,β-catenin變化不明顯。實驗發(fā)現(xiàn),LiCl在促HFSCs分化中,激活Wnt/β-catenin信號通路,抑制降解復合物重要成分GSK-3β的表達下降,促使β-catenin在細胞漿表達增加并轉入核內,增加靶基因轉錄,表明LiCl促HFSCs分化的效應與Wnt/β-catenin信號通路激活有關。 3.掃描電鏡觀察細胞在PLGA-ADM材料上生長良好,分泌的胞外基質豐富,并隨時間進展,細胞逐漸融合,細胞外基質分泌逐漸增多。DIO染色觀察HFSCs均勻分布于真皮替代物中。細胞生長曲線測定表明細胞在材料上生長良好。細胞活性染色檢測到構建皮膚上還有克隆團生長。 結論: 1.人HFSCs在體外有較強的增殖及傳代能力,1×10~5/ml接種密度是促進HFSCs增殖的最佳密度; 2.LiCl可促HFSCs分化明顯,促增殖效應弱于K-SFM條件培養(yǎng)基,當LiCl10 mmol/L濃度是促HFSCs分化的最佳濃度,但增殖效應減弱;KGF可促進HFSCs向表皮分化,是促進HFSCs增殖和遷移,促進創(chuàng)面再上皮化,促進創(chuàng)面愈合的重要因素。LiCl和KGF促HFSCs分化作用可能與激活Wnt/β-catenin信號通路,促使β-catenin表達改變,激活了Wnt信號的相關靶基因的轉錄。 3. PLGA材料具有良好的細胞相容性,人HFSCs能在其上較好的粘附和生長。構建人HFSCs的LiCl-PLGA復合物,能夠使構建皮膚的種子細胞定向分化,使構建帶有皮膚附屬器的組織工程替代物成為可能;構建人HFSCs的KGF-PLGA復合物,能夠加快膜片表面細胞生長。
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【學位授予單位】：廣州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2410339