【摘要】：研究背景 由心肌梗死(Myocardial Infarction, MI)引起的缺血性心臟病(IschemicHeart Disease, IHD)是導(dǎo)致心力衰竭(Heart Failure, HF)的主要病因之一。盡管調(diào)脂、抗血小板等治療可以減少動脈粥樣硬化和冠心病的風(fēng)險(xiǎn)，以及早期介入治療可以使MI病人的死亡率顯著下降，但是MI后心肌細(xì)胞、心肌組織壞死和心功能降低，終末期時(shí)心室發(fā)生重構(gòu)，心功能顯著降低，心血管事件增多。心臟移植雖然是一種有效的治療方法，但因?yàn)楣w的數(shù)量有限，不能滿足臨床需要。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells, BMMSCs)移植治療MI后的HF已經(jīng)得到了初步的臨床試驗(yàn)結(jié)果，誘導(dǎo)其分化形成為心肌樣細(xì)胞的方法目前有很多，但獲得的心肌樣細(xì)胞在的生理學(xué)特性研究尚未完全明確，不同的誘導(dǎo)方法是否對細(xì)胞功能產(chǎn)生不同的影響也尚未明確。隨著研究的深入，或許在不久的將來可以發(fā)現(xiàn)一種有效的聯(lián)合誘導(dǎo)方法，使BMMSCs誘導(dǎo)分化的心肌樣細(xì)胞具備良好的功能狀態(tài)，從而發(fā)揮最大的治療效果。 研究目的 1. SD大鼠BMMSCs體外分離、培養(yǎng)、純化及鑒定。 2.分別用5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2誘導(dǎo)SD大鼠BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，檢測分化率和心肌特異性蛋白表達(dá)。 3.檢測5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2誘導(dǎo)SD大鼠BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的電生理特性。 研究方法 1. SD大鼠BMMSCs體外分離、培養(yǎng)、純化及鑒定：采用脫頸法處死SD大鼠后分離四肢長骨，獲取全骨髓細(xì)胞之后采用密度梯度離心法和差速貼壁法棄除骨髓中的其他細(xì)胞，得到純化的BMMSCs。使用倒置相差顯微鏡每日觀察BMMSCs在培養(yǎng)傳代過程中細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并使用流式細(xì)胞儀檢測BMMSCs表面標(biāo)記抗原CD29(+)、CD44(+)和CD45(-)，進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定。各組細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后，形態(tài)由不規(guī)則星形逐漸成為長梭形，表現(xiàn)出心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。 2. BMMSCs經(jīng)5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的分化率和心肌特異性蛋白表達(dá)：傳代純化之后取第4代細(xì)胞，分為5個實(shí)驗(yàn)組：5-AZA組(10μmol/L)，Ang-II組(0.1μmol/L)，PFT-α (20μmol/L)組，BMP-2(10μg/L)組和正常對照（Control）組。各實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)24h后換正常完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4w，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用流式細(xì)胞儀測定心肌樣細(xì)胞分化率，Western Blot測定縫隙蛋白43(Cx43)和心肌肌鈣蛋白I (cTnI)表達(dá)量，免疫熒光染色測定誘導(dǎo)后1w和4w肌鈣蛋白T(cTn T)表達(dá)。 3.檢測5-AZA、Ang-II、PFT-α、BMP-2誘導(dǎo)SD大鼠BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的電生理特性：取第4代細(xì)胞分組誘導(dǎo)第4w時(shí)，采用激光共聚焦測定反映各組細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化的fluo3/AM熒光表達(dá)水平，采用膜片鉗測定各組細(xì)胞的鉀通道電流密度水平。 研究結(jié)果 1. SD大鼠BMMSCs原代培養(yǎng)、傳代形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及表面抗原鑒定：原代細(xì)胞形狀多成不規(guī)則星形或者短梭形，且可見細(xì)胞之間存在突起互相連接。原代細(xì)胞分離培養(yǎng)7d后快速增殖并形成集落，呈長梭形。傳3~4代后細(xì)胞體積比原代細(xì)胞增大，細(xì)胞形態(tài)及生長排列趨向一致。采用流式細(xì)胞儀檢測BMMSCs表面特異性抗原CD44、CD29和陰性表面抗原CD45，CD44陽性表達(dá)率為(91.4±1.2)%，CD29陽性表達(dá)率為(89.6±2.7)%，而CD45陽性表達(dá)率為(1.8±1.3)%。 2.各組誘導(dǎo)分化率和心肌特異性蛋白表達(dá)：流式細(xì)胞儀測定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分化率，結(jié)果如下：5-AZA組分化率為(23.7±2.1)%，Ang-II組為(23.5±1.6)%，BMP-2組為(17.5±2.3)%，PFT-α組為(28.9±0.9)%，而對照組為(1.5±1.4)%。5-AZA組與Ang-II組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)，其余各組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。免疫熒光染色檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞cTn T蛋白表達(dá)程度，結(jié)果顯示除對照組外各組在誘導(dǎo)后1w均有弱表達(dá)，誘導(dǎo)后4w均有強(qiáng)表達(dá)，而對照組在誘導(dǎo)后1w和4w均為少量表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示在誘導(dǎo)后4w，各實(shí)驗(yàn)組均有Cx43蛋白表達(dá)，5-AZA組蛋白表達(dá)量高于其他實(shí)驗(yàn)組(P0.05)，PFT-α組表達(dá)量較BMP-2組和Ang-II組多(P0.05)，而BMP-2表達(dá)量較Ang-II組多(P0.05)，對照組表達(dá)量顯著低于各實(shí)驗(yàn)組(P0.01)。同時(shí)各實(shí)驗(yàn)組均有cTn I蛋白表達(dá)，PFT-α較其他各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量多(P0.05)，5-AZA組與Ang-II組之間無明顯差異(P0.05)，BMP-2組較其他各實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量較少(P0.05)，對照組蛋白表達(dá)量顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P0.01)。 3.各組誘導(dǎo)SD大鼠BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的電生理特性：激光共聚焦顯微鏡檢測fluo3熒光表達(dá)水平，結(jié)果顯示5-AZA組熒光強(qiáng)度為(1686.177±499.122)，Ang-II組熒光強(qiáng)度為(2627.666±407.329)，PFT-α組熒光強(qiáng)度為(2156.606±385.355)，BMP-2組熒光強(qiáng)度為(1301.910±338.681)，而對照組中熒光強(qiáng)度為(824.928±222.399)。熒光強(qiáng)度Ang-II組高于其他實(shí)驗(yàn)組(P0.01)，PFT-α組熒光強(qiáng)度顯著比5-AZA組和BMP-2組高(P0.01)，5-AZA組熒光強(qiáng)度顯著較BMP-2組高(P0.01)，對照組表達(dá)顯著低于各實(shí)驗(yàn)組(P0.01)。使用膜片鉗檢測各組細(xì)胞鉀通道電流密度水平，結(jié)果顯示，在+70mV時(shí)的穩(wěn)態(tài)電流中，電流密度(pA/pF)在5-AZA組中為(24.931±1.421)，，Ang-II組為(25.134±1.481)，PFT-α組為(27.102±1.321)，BMP-2組為(20.485±1.236)，而對照組中電流密度為(18.053±1.241)。電流密度PFT-α組最高，較其他組均有顯著差異(P0.01)，其中PFT-α組vs.Ang-II組(P0.05)；5-AZA組和Ang-II組之間無顯著差異(P0.05)，較BMP-2組和對照組有顯著差異(P0.01)；BMP-2組比對照組電流密度強(qiáng)，具有顯著差異(P0.01)。 研究結(jié)論 1.采用密度梯度離心法和差速貼壁法聯(lián)合使用可以得到純化的原代BMMSCs，通過流式細(xì)胞儀測定BMMSCs的表面特異性抗原CD29(+)和CD44(+)以及CD45(-)可以鑒定分離培養(yǎng)的原代BMMSCs的純度。 2. BMMSCs經(jīng)5-AZA (10μmol/L)，BMP-2(10μg/L)，PFT-α (20μmol/L)，Ang-II (0.1μmol/L)誘導(dǎo)可以向心肌樣細(xì)胞分化。分化率PFT-α最高，5-AZA與Ang-II無明顯差別，BMP-2分化率在實(shí)驗(yàn)組中最低。 3.各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞游離鈣離子濃度變化的熒光強(qiáng)度Ang-II PFT-α5-AZA BMP-2 Control，經(jīng)不同誘導(dǎo)劑作用后細(xì)胞內(nèi)鈣離子代謝水平較未誘導(dǎo)細(xì)胞有不同程度的提高。 4.各實(shí)驗(yàn)組鉀電流測定，電流密度PFT-α組最高，5-AZA組和ANG-II組其次，BMP-2組在實(shí)驗(yàn)組中最低。各誘導(dǎo)組均比對照組電流密度強(qiáng)，提示經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)之后細(xì)胞膜表面可開放鉀通道數(shù)量分化成熟增多，使電流密度增強(qiáng)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 燕學(xué)波;呂安林;劉博武;侯婧;黃煒;李W

本文編號：2407430