【摘要】：因齲齒或牙周疾病導(dǎo)致的牙齒缺失是人群中的常見(jiàn)病、多發(fā)病，世界衛(wèi)生組織（WHO）將牙齒疾病列為人類(lèi)發(fā)病率最高的三大非傳染性疾病之一。臨床常用的修復(fù)牙齒缺失的方法，如人工材料替代缺失牙齒等，會(huì)引起包括免疫排斥在內(nèi)的諸多不良反應(yīng)。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展為牙齒再生提供了新的思路。牙髓干細(xì)胞（DPSCs）、牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）、牙囊干細(xì)胞（DFSCs）、根尖乳頭干細(xì)胞（SCAP）、人類(lèi)脫落乳牙干細(xì)胞（SHEDs）等牙源性干細(xì)胞均表現(xiàn)出了良好的牙向分化潛能，可用作牙齒組織工程的種子細(xì)胞，但因其在成人尤其是老年人中來(lái)源有限，限制了臨床應(yīng)用；非牙源性干細(xì)胞，如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSC），亦能夠形成牙齒樣及牙周樣組織，但其在臨床獲取相對(duì)不便，且BMSC隨著供體年齡增加其多項(xiàng)分化能力明顯下降，亦存在著諸多不利因素，制約了其在牙齒再生領(lǐng)域的應(yīng)用。 脂肪干細(xì)胞（ASC）來(lái)源廣泛，取材方便，含量豐富，在體內(nèi)及體外試驗(yàn)中均顯示出了良好的自我更新及多向分化潛能，并且其向礦化組織分化的能力不受供體年齡的影響。因此，，本實(shí)驗(yàn)首先在體外分離、培養(yǎng)并鑒定了大鼠脂肪干細(xì)胞，然后探討了其向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的可能性及其條件，以期為牙齒組織工程種子細(xì)胞的研究提供新的思路。 方法 1.原代分離培養(yǎng)SD大鼠脂肪干細(xì)胞，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。將原代細(xì)胞培養(yǎng)傳代純化至第三代后采用MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脂肪干細(xì)胞表面標(biāo)志物。 2.取第三至四代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠脂肪干細(xì)胞，TNE消化收獲細(xì)胞，接種于6孔板。分別以成骨及成脂誘導(dǎo)基誘導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞骨向及脂向分化。而后進(jìn)行ALP染色、茜素紅染色及油紅O染色實(shí)驗(yàn)。 3.消化收獲第三至四代生長(zhǎng)狀況良好的大鼠脂肪干細(xì)胞，接種后用MIP-3α聯(lián)合成骨誘導(dǎo)基誘導(dǎo)。分別于第1、4、7天行ALP活性檢測(cè)，并以PR-PCR及Westen Blotting檢測(cè)成牙本質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因及蛋白。以常規(guī)培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基做為對(duì)照組。 結(jié)果 1.大鼠脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，MTT法測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示大致“S”型。表面標(biāo)志物CD29+、CD49d+、CD45-。 2.成骨誘導(dǎo)顯示2周時(shí)光鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞向心性聚集生長(zhǎng)，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)高透光結(jié)節(jié)狀顆粒。ALP染色可見(jiàn)胞核周?chē)睾谏w粒。3周時(shí)茜素紅染色可見(jiàn)紅色鈣化結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)顯示1周時(shí)細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)散在脂滴，并不斷增大。3周時(shí)油紅O染色可見(jiàn)胞質(zhì)分布大量紅色大小不一的圓形脂滴，胞核藍(lán)染位于細(xì)胞一側(cè)。成骨及成脂誘導(dǎo)表明本實(shí)驗(yàn)使用的大鼠脂肪干細(xì)胞具有多項(xiàng)分化潛能。 3.成牙本質(zhì)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，大鼠脂肪干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后ALP活性增高，且在mRNA水平表達(dá)成牙本質(zhì)標(biāo)志基因及蛋白，高于成骨誘導(dǎo)液組（P0.05）；并且表達(dá)量隨時(shí)間的推移而增加(P0.05)。常規(guī)培養(yǎng)基組無(wú)成牙本質(zhì)標(biāo)志基因及蛋白的表達(dá)。 結(jié)論 1.大鼠脂肪干細(xì)胞原代分離培養(yǎng)成功，具有良好的生長(zhǎng)趨勢(shì)及自我更新能力。CD29+、CD49d+、CD45-提示本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為比較單一的未分化的脂肪來(lái)源干細(xì)胞。 2.大鼠脂肪干細(xì)胞在合適的誘導(dǎo)條件下能夠向骨及脂肪分化，具有多向分化潛能。 3.成牙本質(zhì)誘導(dǎo)后大鼠脂肪干細(xì)胞礦化能力增加，并能夠表達(dá)成牙本質(zhì)特異性基因及蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間短，誘導(dǎo)效能高，與以往方法相比具有更加切實(shí)可行的臨床意義。
[Abstract]:Tooth loss due to dental caries or periodontal disease is one of the most common diseases in the population, and the World Health Organization (WHO) is one of the three major non-communicable diseases with the highest incidence of human morbidity. The most commonly used methods of repairing the missing teeth, such as artificial material replacement for missing teeth, can cause a number of adverse reactions, including immune rejection. The emergence and development of tissue engineering technology provides a new way for tooth regeneration. Dental pulp stem cells (DPSCs), periodontal ligament stem cells (PDLSCs), dental follicle stem cells (DSCs), apical papilla stem cells (SCAP), and human exfoliated breast stem cells (SHEDs) exhibited good tooth-to-differentiation potential and can be used as seed cells for dental tissue engineering, however, because of its limited source in adult, especially in that elderly, the clinical application is limited; non-dental origin stem cells, such as bone marrow stromal stem cells (BMSC), can also form tooth-like and periodontal-like tissue, but they are relatively inconvenienced in clinical acquisition, in addition, that BMSC, with the increase of the age of the donor, has a significant decrease in its multiple differentiation ability, and there are many unfavorable factors, which restrict the application of the BMSC in the field of tooth regeneration. The origin of the adipose-derived stem cells (ASC) is wide, the materials are convenient, the content is abundant, good self-renewal and multi-directional differentiation potential are shown in the in-vivo and in-vitro test, and the ability to differentiate into the mineralized tissue is not affected by the donor's age In this experiment, the rat adipose-derived stem cells were isolated, cultured and identified in vitro, then the possibility and conditions of the differentiation to the odontoid-like cells were discussed, with a view to providing a new thought for the study of the seed cells of the tooth tissue engineering. Road. Method 1. Primary isolated cultured SD rat adipose-derived stem cells, and the morphology of the cells was observed with an inverted microscope. and the cell growth curve is measured by the MTT method after the primary cell culture is passaged and purified to the third generation, and the fat stem cell is detected by the flow cytometry. Surface marker. 2. Rat fat stem cells with good growth status from third to fourth generation, and TNE digested and harvested cells. and inoculating to a 6-hole plate to induce the adipose-derived stem cells of the rat in the form of a bone and a fat-forming induction group, respectively. the bone is differentiated to the fat, then the ALP is stained, the fluorescein red is dyed and Oil red O staining test. 3. The third to fourth generation of fat stem cells from the third to fourth generation were digested and harvested, and the cells were inoculated with MIP-3. The ALP activity was detected in the 1st, 4th and 7th day, respectively, and the dentin was detected by PR-PCR and Westen Blotting. cell marker gene and protein. Pei Pei The results showed that the growth status of the adipose-derived stem cells in the rat was good, and the growth curve of the cell growth curve was generally "S" type. Surface marker CD29 + CD49d +, CD45-. long, high light-transmitting nodular particles in the cytoplasm. The staining of ALP can be seen in the dark brown granules around the nucleus. In the week, red and calcified nodules were seen in the red staining of the red blood. In the case of lipid-induced display, the peripheral blood of the cells was scattered on the surface of the lipid droplets, and increased. At the end of the third week, the red O-staining of the oil showed a large number of red and different levels of red blood. A drop of circular fat, and the nucleus of the nucleus is located on one side of the cell. The bone and the fat-forming induce the use of this experiment. The rat adipose-derived stem cells had a number of differentiation potential. 3. The induction of the dentine in the rat indicated that the ALP activity of the rat adipose-derived stem cells increased after induction, and the mRNA level was expressed as the dentin marker gene and the protein, which was higher than that of the bone-inducing liquid group (P0.05); and the expression of the protein was higher than that of the bone-inducing liquid group (P0.05). The increase of the amount over time (P0.05). base group Conclusion: The primary separation of the rat adipose-derived stem cells The culture was successful, with good growth tendency and self-renewal ability. CD29 +, CD49d +, CD45-prompting the experiment The cells used are relatively single undifferentiated fat-derived stem cells. in that induction condition, the bone and the fat can be differentiated and have the multi-directional differentiation potential. 3. the mineralization ability of the adipose stem cell of the rat is increased after the dentin induction, and the dentin-specific gene and the protein can be express, the induction time is short, the induction time is short,
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2402878

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