【摘要】：乙型肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,如不及時(shí)治療,會(huì)導(dǎo)致肝硬化、肝癌等惡性疾病,甚至死亡。疫苗接種是預(yù)防乙肝的有效手段,但是對(duì)于乙肝治療尤其是慢性乙肝的治療卻作用甚微——傳統(tǒng)的疫苗主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng),而產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)較弱,細(xì)胞免疫在清除機(jī)體內(nèi)病毒發(fā)揮著核心作用。為此研發(fā)可引發(fā)高水平細(xì)胞免疫反應(yīng)的疫苗成為疫苗研究的熱點(diǎn)。治療性疫苗因可誘發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫而受到研究人員的青睞,而DNA疫苗則是治療性疫苗中頗具前景的一員。 DNA疫苗雖可誘發(fā)較為理想的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),但仍存在一定不足,即在個(gè)體較大的動(dòng)物以及人中誘發(fā)的免疫反應(yīng)較弱,免疫效果不理想。為此研究人員通過(guò)不同途徑尋求克服此缺點(diǎn)的方法。佐劑可以有效增強(qiáng)抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)并有效延長(zhǎng)其發(fā)揮效用的時(shí)間,故被認(rèn)為是一種增強(qiáng)疫苗免疫效果的理想方法。黃芪多糖(APS)是中藥黃芪的主要活性成分,具有良好的免疫增強(qiáng)作用,可促進(jìn)機(jī)體CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖以及IL-2和IFN-γ的水平,促進(jìn)脾細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞的增殖,同時(shí)可以促使樹突細(xì)胞成熟,增強(qiáng)其抗原呈遞能力并激活巨噬細(xì)胞。本研究選取黃芪多糖作為佐劑,與重組pcDS2質(zhì)粒一同免疫小鼠,通過(guò)檢測(cè)小鼠體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)水平來(lái)評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠免疫反應(yīng)的影響；并研究其對(duì)樹突細(xì)胞成熟的作用,以期闡明其影響免疫反應(yīng)的機(jī)理。 本研究選取6-8周齡健康雌性昆明白小鼠50只,隨機(jī)分為5組,每組10只。各試驗(yàn)組處理分別為：空白對(duì)照,僅注射質(zhì)粒載體,僅注射重組的pcDS2質(zhì)粒,注射pcDS2質(zhì)粒和APS,僅注射APS,并依次命名為Naive組、pcDNA3組、pcDS2組、pcDS2+APS組和APS組。初次免疫時(shí)間設(shè)為0天,初免后的第14和第28天各加強(qiáng)免疫一次,于第35天采集血清測(cè)定抗體含量,制備脾臟細(xì)胞懸液測(cè)定T細(xì)胞增殖能力、表面分子及細(xì)胞因子的表達(dá)水平、CTL殺傷能力以及信號(hào)通路分子NF-κB和p38 MAPK表達(dá)水平。本研究取得的結(jié)果如下： Naive組、pcDNA3組和APS組抗體水平為陰性,pcDS2+APS組抗體含量(8464.8ng/ml)顯著高于pcDS2組(3319.6ng/ml)。CD4+T細(xì)胞表達(dá)IL-4水平(用表達(dá)IL-4 CD4+T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞的比例來(lái)表示)Naive組、pcDNA3組、pcDS2組、pcDS2+APS組、APS組分別為0.64%、0.97%、1.06%、1.42%、0.90%,其中pcDS2+APS組明顯高于其它對(duì)照組,說(shuō)明APS可誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)向Th2型發(fā)展。上述結(jié)果表明APS作為佐劑可增強(qiáng)小鼠的體液免疫反應(yīng)。 Naive組、pcDNA3組、pcDS2組、pcDS2+APS組、APS組的T細(xì)胞增殖刺激指數(shù)分別為1.4、1.4、2.4、3.2和1.7。pcDS2+APS組顯著高于其他對(duì)照組,表現(xiàn)出最佳的增殖能力。CD4’T細(xì)胞IL-2表達(dá)水平Naive組、pcDNA3組、pcDS2組、pcDS2+APS組以及APS組分別為0.26%、0.43%、0.58%、3.42%和0.36%。pcDS2+APS組IL-2表達(dá)水平最高,顯著高于其他組,說(shuō)明APS具有良好的促T細(xì)胞增殖能力。CD4’T細(xì)胞和CD8’T細(xì)胞IFN-y的表達(dá)水平各組(順序同前)分別為0.10%和0.21%、O.10%和0.27%、0.11%和0.30%、0.23%和0.43%以及O.14%和0.27%。pcDS2+APS組表達(dá)水平與其它各組相比差異顯著,說(shuō)明APS具備誘導(dǎo)機(jī)體Thl型免疫反應(yīng)的能力。體內(nèi)CTL殺傷實(shí)驗(yàn)pcDS2+APS組殺傷靶細(xì)胞的水平最高(56.5%),亦顯著高于其它對(duì)照組(Naive組2%,pcDNA3組5.9%,pcDS2組27.6%,APS組3.9%)以上結(jié)果表明APS作為佐劑可增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)。 共刺激信號(hào)分子CD40、CD80、CD86的表達(dá)水平分別為Naive組0.69%、0.57%、0.49%,pcDNA3組0.66%、0.51%、0.55%,pcDS2組0.92%、0.77%、0.88%,pcDS2+APS組1.15%、1.10%、1.23%,APS0.78%、0.64%、0.78%,其中pcDS2+APS組三種分子的表達(dá)均高于其它對(duì)照組,顯示出最強(qiáng)的為T細(xì)胞激活提供第二信號(hào)的能力；DCMHCI類和II類分子以及趨化因子受體CCR7的表達(dá)亦為pcDS2+APS組表達(dá)水平最高。此外,pcDS2+APS組中參與DC成熟信號(hào)通路的分子NF-κB和p38 MAPK表達(dá)水平也高于其他試驗(yàn)組。以上結(jié)果表明APS促進(jìn)了免疫小鼠樹突細(xì)胞的成熟。 綜上所述,APS作為HBV DNA疫苗佐劑可促進(jìn)免疫小鼠DC成熟,提高Th活性,增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。本研究為增強(qiáng)HBV DNA疫苗的免疫效果提供新的途徑,同時(shí)表明APS具備良好的佐劑潛力,展示出良好的應(yīng)用前景。
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【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2398326