發(fā)布時(shí)間：2019-01-01 18:41

【摘要】：目的: 1.對(duì)快速熒光灶抑制試驗(yàn)(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)檢測(cè)體系進(jìn)行本土化改進(jìn),以適應(yīng)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室條件和檢測(cè)需求; 2.對(duì)改進(jìn)后的RFFIT體系進(jìn)行效果評(píng)估; 3.將本室已經(jīng)應(yīng)用成熟的RFFIT體系與狂犬病疫苗抗原檢測(cè)方法進(jìn)行融合,形成改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(modified antibody binding test, M-ABT)。 方法: 1.將BSR(BHK-21小克隆)、BHK-21(金黃地鼠腎細(xì)胞)、MNA(小鼠成神經(jīng)纖維瘤細(xì)胞)三種細(xì)胞以及CVS-11、CTN-181兩株狂犬病病毒分別引入RFFIT檢測(cè)體系,以不同組合方式檢測(cè)10份標(biāo)本,初步鑒定檢測(cè)結(jié)果的一致性;繼而檢測(cè)10~6份人血清樣品,系統(tǒng)比較不同組合方式下RFFIT檢測(cè)結(jié)果的差異。 2.對(duì)1011份人血清樣品進(jìn)行RFFIT檢測(cè),評(píng)估經(jīng)過(guò)本土化改進(jìn)的RFFIT檢測(cè)體系的檢測(cè)效能。 3.利用自行制備的Alexa 488標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體對(duì)200份標(biāo)本進(jìn)行RFFIT檢測(cè),評(píng)估自主制備的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體進(jìn)行RFFIT檢測(cè)的效果。 4.將RFFIT與抗體結(jié)合試驗(yàn)(antibody binding test, ABT)方案融合,在疫苗樣品稀釋、剩余中和抗體檢測(cè)、結(jié)果計(jì)算方面進(jìn)行改進(jìn),形成改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(M-ABT)。應(yīng)用M-ABT對(duì)10種滅活狂犬病疫苗在不同庫(kù)存時(shí)間的疫苗效力進(jìn)行檢測(cè),觀(guān)察疫苗效力隨時(shí)間改變的情況。 結(jié)果: 1.細(xì)胞培養(yǎng):BSR、BHK-21、MNA細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好,建立了這3種細(xì)胞的細(xì)胞種子庫(kù); 2.病毒培養(yǎng):狂犬病病毒CVS-11和CTN-181株對(duì)BSR、BHK-21、MNA細(xì)胞適應(yīng)良好,各代次病毒滴度均高于10~6 FFU/ml,符合RFFIT檢測(cè)體系對(duì)毒種的要求; 3.改變細(xì)胞系和毒種后RFFIT檢測(cè)體系的檢測(cè)效能評(píng)估:10份小批量樣本檢測(cè):分別引進(jìn)BHK-21和MNA細(xì)胞系以及CTN-181病毒株后,RFFIT檢測(cè)結(jié)果與采用BSR和CVS-11組合進(jìn)行檢測(cè)所得結(jié)果間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值均大于0.05;106份大批量樣本的檢測(cè)結(jié)果也表明引入新的細(xì)胞系和毒株后RFFIT檢測(cè)體系與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)體系檢測(cè)結(jié)果間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且有很好的相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)大于0.75。 4.改進(jìn)RFFIT檢測(cè)體系應(yīng)用效果評(píng)估: ⑴不同細(xì)胞系對(duì)RFFIT檢測(cè)結(jié)果的影響:以CVS-11病毒株作為攻擊病毒,分別應(yīng)用BSR、BHK-21、MNA細(xì)胞系,對(duì)1011份人血清樣品進(jìn)行RFFIT檢測(cè),不同檢測(cè)體系的陽(yáng)性檢出率差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值均大于0.05;不同檢測(cè)體系下陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果幾何均值(geometric mean titer, GMT)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值均大于0.05;不同檢測(cè)體系下檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較好,相關(guān)系數(shù)r大于0.75; ⑵不同操作環(huán)境對(duì)RFFIT檢測(cè)結(jié)果的影響:在不同地理位置、操作環(huán)境迥異的實(shí)驗(yàn)室,由相同的操作人員應(yīng)用CVS-11毒株和BHK-21細(xì)胞系對(duì)上述陽(yáng)性人血清標(biāo)本再次進(jìn)行RFFIT檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果與原實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)所得結(jié)果間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值均大于0.05。 5.采用自主制備Alexa 488標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體后RFFIT檢測(cè)體系檢測(cè)效能評(píng)估:對(duì)200份血清樣品的檢測(cè)顯示采用自主制備Alexa 488標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體與進(jìn)口單抗Millipore DFA 5100檢測(cè)結(jié)果差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,相關(guān)系數(shù)r =0.980。 6. M-ABT法的建立和初步應(yīng)用效果分析:10種待測(cè)狂犬病疫苗經(jīng)M-ABT法檢測(cè),結(jié)果顯示疫苗中抗原含量與NIH法測(cè)定結(jié)果差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且具有很好的相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.927,提示M-ABT法可用于監(jiān)測(cè)狂犬病疫苗抗原的效價(jià)變化情況。 結(jié)論: 1.實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用不同細(xì)胞系和狂犬病病毒株進(jìn)行RFFIT檢測(cè):將致病性更弱的CTN-181毒株應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),增加了檢測(cè)安全性;使用常見(jiàn)的BHK-21、MNA細(xì)胞系使更多實(shí)驗(yàn)室建立和應(yīng)用該檢測(cè)技術(shù)成為可能; 2.不同操作環(huán)境對(duì)RFFIT檢測(cè)結(jié)果的影響不明顯,因此,同一批操作人員使用相同的檢測(cè)體系在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行RFFIT檢測(cè)的結(jié)果均衡可比并可信; 3.自主制備的Alexa488標(biāo)記抗狂犬病核蛋白單克隆抗體可以用于國(guó)內(nèi)RFFIT檢測(cè); 4. M-ABT法已經(jīng)建立,用于滅活狂犬病疫苗效力檢測(cè)時(shí)與NIH法檢測(cè)結(jié)果高度一致,是一種合適的滅活狂犬病疫苗效力監(jiān)測(cè)技術(shù)手段。
[Abstract]:Purpose: 1. The localization of the rapid fluorescence focus detection test (RFIIT) detection system is improved to meet the domestic laboratory conditions and detection requirements.? 2. Effect on the improved RFIIT system Fruit evaluation; 3. The room has been fused with a mature RFIIT system and a rabies vaccine antigen detection method to form modified antibody binding test, M -AB Methods: 1. The BSR (BHK-21 small clone), BHK-21 (hamster kidney cell), MNA (mouse fibroblast cell) and CVS-11 and CTN-181 rabies virus were introduced into the RFFIT detection system. the consistency of the detection results is determined; in turn, 10 to 6 human serum samples are detected, and the system is compared with the RFF in different combinations; The difference in the IT test results. 2. The RFFIT test was performed on 1011 human serum samples to assess the localization of the modified RFF the detection efficiency of the IT detection system is 3. 200 samples of the anti-rabies virus nucleoprotein monoclonal antibody prepared by using the self-prepared Alexa 488-labeled anti-rabies virus nucleoprotein monoclonal antibody are used for detecting and evaluating the self-prepared anti-rabies virus nucleoprotein monoclonal antibody. 4. The RFIIT was fused with the antibody binding assay (ABT), and the results were improved and formed in the sample dilution, the remaining neutralizing antibody test and the calculation of the results. Improved antibody binding assay (M-ABT). Detection of the efficacy of 10 inactivated rabies vaccines in different stock times with M-ABT, observe Results: 1. Cell culture: BSR, BHK-21, MNA cell growth In good condition, the cell seed bank of the three cells was established; 2. Virus culture: The rabies virus CVS-11 and the CTN-181 strain were well adapted to the BSR, BHK-21, and MNA cells. and the drop degree of each generation virus is higher than 10-6FFU./ ml, in line with the requirements of the RFFIT detection system for the virus species; 3. Evaluation of the detection efficacy of the RFIIT detection system after the change of the cell line and the virus species: 10 small batch sample testing: introduction of BHK, respectively After the 21 and MNA cell lines and the CTN-181 strain, the results of the RFFIT test were not statistically significant with the results obtained by the combination of the BSR and the CVS-11, and the P-value was greater than 0.05; the results of the detection of 106 large-scale samples also showed that the introduction of new cell lines and the post-strain RFFIT test There is no statistical significance between the test system and the international standard system test results, and and the correlation coefficient (r) is greater than 0.. 75. 4. Improvement of the application effect evaluation of the RFIIT detection system: The effect of different cell lines on the results of RFFIT detection: The CVS-11 virus strain is used as the attack virus, and the BSR and the BHK-21 are respectively applied. In the MNA cell line, 1011 human serum samples were tested by RFFIT. The positive rate of positive detection in different detection systems was not statistically significant, and the P value was greater than 0.05. The geometric mean (GMT) difference of positive samples under different detection systems was not statistically significant. and the P value is greater than 0.05; no The correlation of the test results with the detection system is good, the correlation coefficient r is greater than 0.75, and the influence of different operating environments on the RFFIT detection results is that the CVS-11 strains and the B are applied by the same operators in different geographic locations and different operating environments In the HK-21 cell line, the above-mentioned positive human serum samples were subjected to RFFIT detection, and the results of the test and the original laboratory ring The difference between the results obtained in the context of the detection was not statistically significant, and the P value was greater than 0.05. 5. The self-prepared Alexa 488 standard was used. Evaluation of the efficacy of the RFIIT detection system after the anti-rabies virus nucleoprotein monoclonal antibody: The detection of 200 serum samples shows the use of the self-prepared Alexa 488-labeled anti-rabies virus nucleoprotein monoclonal antibody and the imported monoclonal antibody Millipore The difference of DFA 5100 was not statistically significant, and the correlation coefficient r = 0.980. 6.M-ABT method was established and the preliminary application results were analyzed: 10 rabies vaccines to be tested were tested by M-ABT method, and the results showed that the antigen content in the vaccine and the results of NIH method The difference was not statistically significant and had a good correlation, and the correlation coefficient r = 0. 9 27. It is suggested that the M-ABT method can be used to monitor the change of the titer of the rabies vaccine antigen. the detection safety is increased by the laboratory detection of the rabies virus and the antibody, Using the common BHK-21, the MNA cell line makes it possible to establish and apply the detection technique to more laboratories; 2. The effect of different operating environments on the RFFIT detection results is not clear, and therefore, the same The same test system was used by the batch operators to balance the results of the RFFIT detection in different laboratories and be credible; The self-prepared Alexa488-labeled anti-rabies nucleoprotein monoclonal antibody can be used for domestic RFFIT detection; 4.M-ABT method has been established for killing live rabies
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2397962