【摘要】：目的： 本課題旨在構(gòu)建攜帶同源基因HOXA4的慢病毒表達(dá)載體，體外觀察轉(zhuǎn)染HOXA4基因后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilicalcord mesenchymal stemcells hUCMSCs）的生物學(xué)特性及定向分化為表皮細(xì)胞的能力。為皮膚缺損及燒傷疾病的細(xì)胞治療及基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、使用酶切及PCR技術(shù)從克隆模版HOXA4－MSCV逆轉(zhuǎn)錄載體中獲取目的基因HOXA4，并將HOXA4基因重組到慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒plenti-GFP-CTB上，通過酶切、測(cè)序驗(yàn)證HOXA4基因序列無誤后，將plenti-GFP-HOXA4質(zhì)粒、輔助包裝質(zhì)粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、PMD2G共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞，獲得攜帶HOXA4基因的重組慢病毒Lentil-GFP-HOXA4。 2、將獲取的慢病毒液感染hUCMSCs48h后，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染后的細(xì)胞形態(tài)改變、綠色熒光表達(dá)（GFP）強(qiáng)弱，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其GFP表達(dá)效率。利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法在基因水平上檢測(cè)HOXA4在hUCMSCs中的表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因hUCMSCs細(xì)胞周期。 3、在體外培養(yǎng)條件下，不添加任何誘導(dǎo)因子，將HOXA4基因修飾的hUCMSCs培養(yǎng)誘導(dǎo)分化21d,細(xì)胞免疫組化檢測(cè)特異性表皮細(xì)胞分子標(biāo)志CK18、CK19、人廣譜角蛋白的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CK14、CK18的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)含有HOXA4的質(zhì)粒模版進(jìn)行擴(kuò)增，成功獲取了HOXA4基因，Plenti-GFP-載體成功酶切線性化。細(xì)菌陽性克隆經(jīng)PCR鑒定證明，重組質(zhì)粒plenti-GFP-HOXA4構(gòu)建成功并能在感受態(tài)大腸桿菌中大量擴(kuò)增；測(cè)序結(jié)果顯示，plenti-GFP-HOXA4中HOXA4與質(zhì)粒克隆模版中序列完全一致。慢病毒載體plenti-GFP-HOXA4轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72h后應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在接近1kb處觀察到有目的條帶（目的條帶為936bp），顯示HOXA4基因表達(dá)。在熒光顯微鏡下可觀察到通過慢病毒載體系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中有綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明病毒包裝成功。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定plenti-GFP-HOXA4的病毒滴度為2.11×108TU/ml。 2.基因轉(zhuǎn)染hUCMSCs48h后觀察到較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，當(dāng)病毒感染復(fù)數(shù)（muhiplicities of infection MOI）值為60時(shí)pLenti-GFP-HOXA4及pLenti-GFP的轉(zhuǎn)染率均達(dá)到90%以上，RT-PCR檢測(cè)到目的基因HOXA4在hUCMSCs中表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示80%以上轉(zhuǎn)染基因的hUCMSCs處于G0和G1期，增殖能力未受明顯影響。 3.將HOXA4基因修飾的hUCMSCs在單層培養(yǎng)條件下，體外誘導(dǎo)7d后，少量細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由長(zhǎng)梭性變?yōu)椴灰?guī)則形，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多。到14d細(xì)胞形態(tài)改變更明顯，，呈聚集生長(zhǎng)，并出現(xiàn)多個(gè)突起，在21d左右，通過流式細(xì)胞儀及免疫組化測(cè)到角蛋白14、19，18、人廣譜角蛋白均有表達(dá)，與未轉(zhuǎn)染基因的hUCMSCs比較陽性細(xì)胞比率明顯增多，說明轉(zhuǎn)染HOXA4基因不影響hUCMSCs的體外活性且轉(zhuǎn)基因的hUCMSCs在體外一定條件下可以向表皮細(xì)胞分化。 結(jié)論： 1、HOXA4基因慢病毒載體構(gòu)建成功。 2、hUCMSCs在體外易于被外源基因修飾，且對(duì)其增殖分化無影響。 3、在體外不添加生長(zhǎng)因子及其他誘導(dǎo)因子培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)染了HOXA4基因的hUCMSCs具有較強(qiáng)的向表皮細(xì)胞分化的能力，表明HOXA4基因在調(diào)控表皮細(xì)胞分化過程中發(fā)揮了重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 袁源;楊樹源;韓忠朝;張曉輝;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究[J];中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志;2006年03期

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本文編號(hào)：2394889