【摘要】：研究背景 弓形蟲是一種呈世界性分布的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲。目前世界范圍內(nèi)將近十億人感染弓形蟲。根據(jù)感染途徑,分為獲得性感染和先天性感染兩大類。獲得性感染常通過食入未煮熟的含有包囊的動(dòng)物肉類、生奶、生蛋或誤食了貓糞便中釋放的卵囊而感染。近年研究顯示,越來越多的弓形蟲眼病為獲得性感染,獲得性弓形蟲眼部感染通過免疫介導(dǎo),引起全色素膜炎或壞死性視網(wǎng)膜炎,重癥的色素膜炎可導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離、青光眼及眼內(nèi)炎而失明,隨著弓形蟲感染率的不斷增高,弓形蟲眼病的發(fā)病機(jī)制及有效治療已引起了廣泛關(guān)注。 弓形蟲眼病對(duì)患者視功能損傷嚴(yán)重,弓形蟲感染導(dǎo)致弓形蟲眼病的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。國(guó)內(nèi)對(duì)該病的認(rèn)識(shí)較少,對(duì)弓形蟲眼病的基礎(chǔ)研究更是罕見。為了進(jìn)一步研究弓形蟲眼病的發(fā)病機(jī)制,首先需要建立弓形蟲眼病模型。 小鼠對(duì)弓形蟲RH強(qiáng)毒株極為敏感,經(jīng)腹腔或皮下接種感染小鼠后,可引起急性感染,造成宿主機(jī)體組織損傷,因此,小鼠常作為弓形蟲急性感染的動(dòng)物模型。由于小鼠具有飼養(yǎng)方便、繁殖快、易于實(shí)驗(yàn)操作、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn),因此,建立弓形蟲RH強(qiáng)毒株急性感染小鼠建立獲得性弓形蟲眼病動(dòng)物模型具有重要的實(shí)際意義。 弓形蟲感染后,細(xì)胞免疫起著強(qiáng)有力的抗弓形蟲效應(yīng),參與細(xì)胞免疫的細(xì)胞有T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。T細(xì)胞按其功能可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等亞群,弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)寄生,其感染引起機(jī)體的免疫反應(yīng)以CD4+T細(xì)胞亞群介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為主。 CD4+T細(xì)胞多為Th細(xì)胞(輔助性T細(xì)胞)。根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞因子和生物功能的不同,傳統(tǒng)上將CD4+T細(xì)胞分為Thl和Th2兩類細(xì)胞亞群,它們?cè)诿庖哌^程中相互調(diào)節(jié)并相互制約。已有的研究表明：急性弓形蟲眼部感染時(shí),房水中Thl細(xì)胞分泌的γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平明顯升高,Th2細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素—10(interleukin-10, IL-10)的水平明顯降低。IFN-γ和TNF-α在巨噬細(xì)胞活化、殺滅寄生蟲方面十分重要,是機(jī)體對(duì)抗弓形蟲侵害的主要活性分子。但過量的IFN-γ和TNF-α可能導(dǎo)致免疫應(yīng)答過度,加重組織的炎癥反應(yīng)甚至導(dǎo)致組織壞死等。IL-10又稱為細(xì)胞因子生成抑制因子(CSIF),是IL-10家族的首要成員。已有的研究表明IL-10通過下調(diào)IFN-γ和TNF-α從而在保護(hù)性免疫和免疫病理的平衡中起著重要作用。那么,在小鼠獲得性弓形蟲眼病模型中,通過靜脈注射IL-10,對(duì)外周血和眼內(nèi)房水中的IFN-γ和TNF-α水平如何影響?是否又能進(jìn)一步減輕眼部的炎癥反應(yīng)?文獻(xiàn)中未見到相關(guān)報(bào)道。 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類不同于Thl和Th2細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞,作為一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,此類細(xì)胞在抑制病原體感染免疫中起重要的作用。其發(fā)揮效應(yīng)的一條重要途徑為分泌IL-10。Th17是另一類新發(fā)現(xiàn)的不同于Thl和Th2細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞亞群,以分泌IL-17為主,研究表明,Th17細(xì)胞在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和自身免疫病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。正常情況下,T細(xì)胞及各亞群數(shù)目在周圍組織中相對(duì)穩(wěn)定,T細(xì)胞總數(shù)或其亞群的絕對(duì)數(shù)和比值發(fā)生改變,可視為免疫異常,并與某些疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Treg/Th17的分布在很多疾病的發(fā)生過程中出現(xiàn)了失衡現(xiàn)象,在小鼠獲得性弓形蟲眼病模型中,脾臟中Treg/Th17的平衡狀態(tài)是否發(fā)生了變化,是否能進(jìn)一步闡明弓形蟲感染的發(fā)病機(jī)制?文獻(xiàn)中未見報(bào)道。體外研究表明,IL-10可通過作用于Treg降低Th17的數(shù)量。那么,在獲得性弓形蟲眼病模型中,通過靜脈注射IL-10,對(duì)脾臟中Treg/Th17的平衡狀態(tài)如何影響? 研究目的 本研究通過建立獲得性弓形蟲眼病的C57BL/6小鼠動(dòng)物模型,檢測(cè)小鼠房水和血清中IFN-γ和TNF-α濃度以及小鼠脾臟Treg與Th17細(xì)胞數(shù)量的變化,并探討IFN-γ和TNF-α濃度的變化以及Treg/Th17平衡狀態(tài)與弓形蟲眼部感染的關(guān)系。通過外源性細(xì)胞因子IL-10干預(yù),探討IL一10對(duì)獲得性弓形蟲眼病小鼠體內(nèi)IFN-γ和TNF-α濃度、Treg/Th17的平衡以及對(duì)視網(wǎng)膜組織炎癥的影響。進(jìn)而為弓形蟲眼病的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)一步治療提供重要理論依據(jù)。 研究方法 將160只C57BL/6小鼠分為4組：①對(duì)照組40只；②實(shí)驗(yàn)A組(實(shí)驗(yàn)A組)40只；③0.01ug IL-10干預(yù)組(實(shí)驗(yàn)B組)40只；④O.1ug IL-10干預(yù)組(實(shí)驗(yàn)C組)40只。對(duì)實(shí)驗(yàn)組每只小鼠均通過腹腔注射給予102個(gè)／只(200ul無菌生理鹽水)弓形蟲強(qiáng)毒株(RH株)速殖子,對(duì)照組小鼠注射等體積的生理鹽水,實(shí)驗(yàn)B組于感染蟲體后第2d和第4d通過尾靜脈注射0.0lug IL-10(溶于200ul無菌生理鹽水中)；實(shí)驗(yàn)C組于感染蟲體后第2d和第4d通過尾靜脈注射O.1ug IL-10(溶于200ul無菌生理鹽水中)；感染小鼠后第6天,分別處死小鼠,摘取眼球,收集外周血,取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟。應(yīng)用套式PCR技術(shù)對(duì)外周血做基因檢測(cè)；對(duì)小鼠眼球做石蠟切片和HE染色,觀察小鼠眼部的組織病理學(xué)切片改變；通過ELISA試劑盒檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組房水和血清中IFN-γ和TNF-α濃度,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟Treg和Th17細(xì)胞的數(shù)量變化,計(jì)算脾臟Treg/Th17的比值。通過小鼠尾靜脈注射IL-10后,觀察其對(duì)血清和房水中IFN-γ和’INF-α的濃度、Treg/Th17以及視網(wǎng)膜炎癥的影響。 研究結(jié)果 1.PCR檢測(cè)弓形蟲感染第6天,在實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血中可檢測(cè)到小鼠P30基因。 2.不同組視網(wǎng)膜組織學(xué)切片的變化弓形蟲感染第6天,實(shí)驗(yàn)A組視網(wǎng)膜組織可見到弓形蟲,且出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)；0.01ugIL-10注射后,視網(wǎng)膜組織中炎癥反應(yīng)仍比較明顯；0.1ugIL-10注射后,視網(wǎng)膜組織中仍可見到弓形蟲,但炎癥反應(yīng)減輕。 3.不同組房水中IFN-γ和TNF-α的濃度變化弓形蟲感染第6天,實(shí)驗(yàn)A組房水中IFN-γ (4531.4pg/ml)和TNF-α (1572.3pg/ml)的濃度升高較對(duì)照組房水中IFN-γ (12.3pg/ml)和TNF-α的濃度(1165.2pg/m1)；0.0lugIL-10注射后,房水中IFN-γ (3838.7pg/ml)和TNF-α (1431.1pg/ml)的濃度變化甚微,0.1ugIL-10注射后,房水中IFN-γ (2482.7pg/ml)和TNF-α (1248.1pg/ml)的濃度較實(shí)驗(yàn)A組降低。 4.不同組血清中IFN-γ和TNF-α的濃度變化弓形蟲感染第6天,實(shí)驗(yàn)A組血清中IFN-γ (455.7±39pg/ml)較對(duì)照組血清中IFN-γ的濃度(16.4±3.1pg/m1)升高；實(shí)驗(yàn)A組血清中TNF-α (14.6±2.2pg/ml)較對(duì)照組血清中TNF-α的濃度(8.7±2.1pg/m1)升高；0.01ugIL-10注射后,實(shí)驗(yàn)B組血清中IFN-γ(389.8±42pg/m1)和TNF-α(13.1±1.7pg/ml)的濃度較實(shí)驗(yàn)A組降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但炎癥反應(yīng)仍比較明顯；0.1ugIL-10注射后,血清中IFN-γ(265.7±27pg/ml)和TNF-α(12.1±1.9pg/ml)的濃度較實(shí)驗(yàn)A組降低更為明顯,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,視網(wǎng)膜組織中仍可見到弓形蟲,但炎癥反應(yīng)減輕。 5.各組Treg占CD4+細(xì)胞的百分比實(shí)驗(yàn)A組(18.41±5.32)Treg占CD4-細(xì)胞的百分比較對(duì)照組(39.16±12.53)降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)B組Treg占CD4+細(xì)胞的百分比(20.57±5.61)和實(shí)驗(yàn)A組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)；實(shí)驗(yàn)C組(31.27±8.47)Treg占CD4+細(xì)胞的百分比較實(shí)驗(yàn)A組升高,兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。 6.各組Thl7占CD4+細(xì)胞的百分比實(shí)驗(yàn)A組Thl7占CD4+細(xì)胞的百分比(33.15±8.37)較對(duì)照組(9.41±7.54)升高,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)；實(shí)驗(yàn)B組(29.27±7.54)Thl7占CD4+細(xì)胞的百分比和實(shí)驗(yàn)A組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)；實(shí)驗(yàn)C組Th17占CD4‘細(xì)胞的百分比(14.57±9.32)較實(shí)驗(yàn)A組降低,兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。 7.脾臟中Treg/Th17的比值的變化。實(shí)驗(yàn)A組(0.34±0.17)脾臟中Treg/Th17的比值低于對(duì)照組(3.76±1.23),兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)意義,實(shí)驗(yàn)B組(0.51±0.31)脾臟中Treg/Th17的比值和實(shí)驗(yàn)A組相比差異無統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)；實(shí)驗(yàn)C組(2.33±1.16)脾臟中Treg/Th17的比值和實(shí)驗(yàn)A組相比升高,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。 研究結(jié)論 經(jīng)腹腔注射弓形蟲強(qiáng)毒株(RH株)感染C57BL/6小鼠可建立獲得性弓形蟲眼病模型,病變主要集中在視網(wǎng)膜,套式PCR檢測(cè)具有高度的特異性和敏感性。弓形蟲感染后,血清和房水中的IFN-γ和TNF-α的濃度升高,脾臟局部Treg細(xì)胞數(shù)量下降,Thl7細(xì)胞數(shù)量升高,脾臟中Treg/Th17的比值明顯降低,打破了正常的免疫平衡。Treg/Thl7的比值降低以及IFN-γ和TNF-α的濃度升高可能與弓形蟲眼部感染炎癥反應(yīng)有關(guān)。通過尾靜脈注射0.01ug IL-10后,房水和血清中的IFN-γ和TNF-α的濃度降低,Treg/Th17變化不明顯,增加IL-10(0.1ugIL-10)注射后,脾臟中Treg/Thl7比值升高,房水和血清中的IFN-γ和TNF-α的濃度繼續(xù)降低,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)減輕,從而推測(cè)外源性IL-10可能通過降低體內(nèi)的IFN-γ和TNF-α的濃度以及改變體內(nèi)的Treg/Th17的平衡狀態(tài)減輕弓形蟲感染小鼠的眼部炎癥反應(yīng)。 研究意義 通過腹腔注射弓形蟲RH株感染C57BL/6小鼠,建立了獲得性弓形蟲眼病的動(dòng)物模型,為獲得性弓形蟲眼病發(fā)病機(jī)制、治療方法等相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。造模成功后,應(yīng)用組織化學(xué)方法(HE染色)觀察弓形蟲眼病的眼部病理改變特點(diǎn),并對(duì)眼部組織和血液標(biāo)本行套式PCR檢測(cè)弓形蟲P30基因,建立了敏感特異的弓形蟲檢測(cè)方法,PCR檢測(cè)方法不僅能彌補(bǔ)血清學(xué)方法不能檢測(cè)的免疫缺陷患者或動(dòng)物的弓形蟲病,而且PCR檢測(cè)方法更為快速和敏感,可作為臨床上檢測(cè)弓形蟲感染的檢驗(yàn)方法很好的選擇。本研究首次從Treg/Thl7平衡的角度探討弓形蟲感染的發(fā)生機(jī)理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),弓形蟲感染可以導(dǎo)致鼠脾臟Treg細(xì)胞水平降低,而Th17細(xì)胞水平升高,出現(xiàn)了Treg/Th17的失衡。結(jié)果提示,感染引起的Treg/Th17失衡在弓形蟲感染的發(fā)病機(jī)制中可能起到重要的作用。然后,通過小鼠尾靜脈注射IL-10,應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠外周血和眼內(nèi)房水中炎癥因子IFN-γ和TNF-α水平的改變,并檢測(cè)脾臟中Treg/Th17平衡的變化。據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)在小鼠獲得性弓形蟲眼病模型中,眼部的炎癥反應(yīng)可能與體內(nèi)的IFN-γ和TNF-α濃度明顯升高及Treg/Th17的降低有關(guān),外源性IL-10可能通過降低血清和房水中IFN-γ和TNF-α的濃度及改變體內(nèi)Treg/Th17的平衡及減輕了小鼠弓形蟲感染的眼部炎癥反應(yīng),IL-10注射有可能成為治療弓形蟲眼病的一種新的途徑。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2393862