發(fā)布時間：2018-12-27 15:19

【摘要】：研究背景 近年來冠心病(Coronary Heart Disease, CHD)發(fā)病率逐年增加,特別是心肌梗死(Myocaridal Infarction, MI)等導(dǎo)致的缺血性心肌病(Ischemic Cardiomyopathy, ICM)已成為影響人類健康的主要疾病之一。最近研究表明心肌梗死后也有少量的心肌細(xì)胞發(fā)生分裂增殖,但是分裂增殖的細(xì)胞數(shù)量偏少,每年1%更新率不足以彌補(bǔ)心肌梗死時大量心肌細(xì)胞的壞死。因此心肌梗死引起的大量心肌細(xì)胞壞死最終導(dǎo)致缺血性心肌病的發(fā)生,引發(fā)嚴(yán)重心力衰竭和各種心血管并發(fā)癥,五年死亡率高達(dá)45%左右。盡管冠心病的藥物治療、外科搭橋技術(shù)和介入治療技術(shù)不斷提高,但是死亡率仍居高不下。因此心肌梗死后,如何修復(fù)壞死心肌細(xì)胞一直是科研人員和臨床醫(yī)師面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。近年來干細(xì)胞移植治療為缺血性心肌病患者帶來新的曙光,目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)移植治療心肌梗死的研究已取得令人鼓舞的進(jìn)展,但如何誘導(dǎo)BMMSCs獲得足夠數(shù)量的心肌樣細(xì)胞成為研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。隨著研究的深入,在不久的將來將逐步解決在心肌梗死后缺血性心肌病的BMMSCs移植治療過程中出現(xiàn)的各種問題,并獲得顯著療效。 研究目的 1.探討大鼠BMMSCs體外分離、純化、傳代及鑒定方法。 2.觀察PFT-α對大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影響及可能機(jī)制。 3.探索PFT-α對大鼠BMMSCs向心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響路徑及其可能機(jī)制。 研究方法 1.大鼠BMMSCs體外分離、純化及鑒定:采用頸椎脫臼法處死大鼠后分離下肢長骨,將獲取的骨髓細(xì)胞通過密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法去除BMMSCs中混雜的其他細(xì)胞,獲得純化的BMMSCs。倒置相差顯微鏡下觀察BMMSCs在培養(yǎng)傳代過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測BMMSCs陽性表面標(biāo)記抗原CD44和陰性標(biāo)記抗原CD45進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2. PFT-α對大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影響:取第4代BMMSCs,采用MTT法檢測PFT-α的細(xì)胞毒性。同時進(jìn)行分組處理:空白對照組(CON)、5-AZA組(10μmol/L)、PFT-α組(20μmol/L)、5-AZA+PFT-α組(10μmol/L+20μmol/L)。MTT法檢測PFT-α對BMMSCs增殖的影響,流式細(xì)胞儀檢測PFT-α對BMMSCs凋亡的影響,Western Blotting法檢測P53、P21蛋白的表達(dá)。 3. PFT-α誘導(dǎo)BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞:取第4代BMMSCs進(jìn)行分組誘導(dǎo),空白對照組(CON)、5-AZA組(10μmol/L)、PFT-α組(20μmol/L)、5-AZA+PFT-α組(10μmol/L+20μmol/L)。各組誘導(dǎo)24 h后更換常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4 w。顯微鏡下觀察不同時間點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,免疫熒光染色法鑒定各組BMMSCs誘導(dǎo)后1 w、4 w時心肌肌鈣蛋白I (cTn I)和鏈接蛋白-43(CX-43)的表達(dá);Western Blotting法檢測cTn I、P53、P21蛋白的表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測心肌樣細(xì)胞分化率。 研究結(jié)果 1.大鼠BMMSCs體外培養(yǎng)形態(tài)特征及鑒定:原代BMMSCs體積較小,形態(tài)多樣,大部分細(xì)胞為橢圓形、短梭形,7 d后細(xì)胞體積增大,以長梭形為主,形成細(xì)胞集落。傳代后細(xì)胞呈長梭形、旋渦狀生長,且排列緊密、形態(tài)均一、趨向一致。流式細(xì)胞儀檢測BMMSCs表面標(biāo)志抗原CD44和CD45,結(jié)果顯示:CD44陽性表達(dá)率為(89.98±1.29)%,CD45陽性表達(dá)率為(2.14±0.22)%。 2. PFT-α對大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影響:MTT法檢測不同濃度PFT-α的細(xì)胞毒性,結(jié)果顯示:當(dāng)PFT-α濃度等于或者低于20μmol/L時,對BMMSCs的增殖有一定促進(jìn)作用,而當(dāng)其濃度達(dá)到40μmol/L時,PFT-α則可明顯抑制BMMSCs的增殖,當(dāng)濃度達(dá)到80μmol/L時,PFT-α顯著抑制BMMSCs細(xì)胞的增殖;MTT法檢測PFT-α對BMMSCs增殖的影響,結(jié)果顯示:BMMSCs在處理后前3 d,各組細(xì)胞增殖沒有明顯差異,在第5 d時,5-AZA組對BMMSCs增殖表現(xiàn)出明顯抑制,與CON組、PFT-α組及5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),在第7 d時,也同樣表現(xiàn)出這樣的差異(P0.01),并且PFT-α組和5-AZA+PFT-α組BMMSCs增殖明顯優(yōu)于空白對照組(P0.01);流式細(xì)胞儀檢測各組BMMSCs凋亡率,結(jié)果顯示:5-AZA組細(xì)胞凋亡率最高,與CON組、PFT-α組及5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),其余3組無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);Western blotting法測定P53、P21蛋白表達(dá),結(jié)果顯示:5-AZA組表達(dá)量明顯強(qiáng)于其余3組,與CON組、PFT-α組、5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.001);而PFT-α組P53、P21蛋白表達(dá)量明顯減少,與CON組和5-AZA+PFT-α組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),CON組和5-AZA+PFT-α組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 3. PFT-α誘導(dǎo)BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的鑒定:各組BMMSCs誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:除CON組外,各組細(xì)胞誘導(dǎo)約2 w后,開始出現(xiàn)細(xì)胞體積及核增大,大部分細(xì)胞變?yōu)殚L梭狀。誘導(dǎo)4 w時鄰近細(xì)胞間連接較前緊密,并形成肌節(jié)樣結(jié)構(gòu);免疫熒光染色鑒定結(jié)果:誘導(dǎo)后1 w時CON組未見cTn I和CX-43免疫熒光表達(dá),其余3組均可見少量表達(dá)。誘導(dǎo)后4 w時可見CON組少量表達(dá)cTn I和CX-43,其余3組均強(qiáng)表達(dá)cTn I和CX-43,并可見肌管樣結(jié)構(gòu);Western Blotting檢測cTn I的表達(dá),1 w時CON組未見表達(dá)cTn I,其余3組均有少量表達(dá)。4 w時,CON組可見少量表達(dá),其余3組均有強(qiáng)表達(dá)。各組cTn I表達(dá)在4 w時均明顯高于1 w時的表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測心肌樣細(xì)胞的分化率,結(jié)果顯示:CON組分化率為(2.34±0.91)%,5-AZA組為(21.47±5.41)%,PFT-α組為(29.85±1.96)%,5-AZA+PFT-α組為(30.97±5.74)%,5-AZA組、PFT-α組和5-AZA+PFT-α組與CON組比較均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),PFT-α組、5-AZA+PFT-α組與5-AZA組比較均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P 0.01) , PFT-α組和5-AZA+PFT-α組無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);Western Blotting檢測P53、P21蛋白表達(dá),結(jié)果顯示:誘導(dǎo)1 w時,5-AZA組P53、P21表達(dá)最強(qiáng),PFT-α組幾乎不表達(dá),5-AZA組與其余3組比較均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),PFT-α和5-AZA+PFT-α組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。誘導(dǎo)4 w時,5-AZA組仍強(qiáng)表達(dá),其余3組表達(dá)較1 w時有所增強(qiáng),5-AZA組、PFT-α組、混合組與CON組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),5-AZA組與PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。PFT-α組、混合組組內(nèi)誘導(dǎo)4 w時P53、P21表達(dá)量與1 w時比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 研究結(jié)論 1.采用密度梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法能夠獲得純化的BMMSCs,通過觀察BMMSCs形態(tài)學(xué)特征和檢測BMMSCs陽性標(biāo)記抗原CD44和陰性標(biāo)記抗原CD45,可以鑒定純化的BMMSCs。 2. PFT-α可以促進(jìn)BMMSCs的增殖,抑制BMMSCs的凋亡。當(dāng)PFT-α濃度≤20μmol/L時,對BMMSCs無毒性作用,能夠促進(jìn)BMMSCs增殖,抑制BMMSCs凋亡。當(dāng)濃度20μmol/L時則抑制細(xì)胞增殖,具有細(xì)胞毒性。 3. PFT-α能夠誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化,且分化率比5-AZA組提高了39%,具有顯著性差異(P0.01)。 4. PFT-α可能是通過抑制P53,阻斷P53-P21蛋白通路抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2393264