【摘要】：研究背景和目的： 炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一種遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素共同參與的腸道慢性非特異性炎癥性疾病。包括克羅恩病(Crohn's disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC),呈間歇性反復發(fā)作。IBD在歐美的發(fā)病率高于發(fā)展中國家,但近年來我國的IBD發(fā)病率明顯上升。雖然目前IBD病因?qū)W和發(fā)病機制仍未明確,但越來越多的證據(jù)支持Th1/Th2型反應失衡介導的免疫異常在炎癥性腸病發(fā)病中起重要作用。根據(jù)所分泌細胞因子和介導免疫功能的不同,CD4+T細胞可分為1型輔助性T細胞(Thl細胞)和2型輔助性T細胞(Th2細胞)兩型。Thl型細胞主要分泌干擾素-γ(interferon-γ,IFN-y)、白介素-2(interleukin-2,IL-2)和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α),Th2型細胞分泌白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)和白介素-10(IL-10)。CD的免疫類型主要偏向于Th1型,而UC主要是Th2型疾病。 細胞因子分為促炎因子和抑炎因子。促炎因子和抑炎因子的失衡在炎癥性腸病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。促炎因子如白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、TNF-α和IFN-γ等由單核細胞和巨噬細胞分泌,參與細胞免疫；抑炎因子如IL-4、IL-5和IL-10等由T細胞分泌,參與體液免疫反應。其中,IL-10和IL-4是最重要的兩種抑炎因子。 IL-10可由多種細胞產(chǎn)生,包括T細胞(CD4+和CD8+)、B細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞。由1號染色體上的五個外顯子編碼。IL-10能抑制TNF-α、INF-γ、IL-6等促炎因子的產(chǎn)生。IL-10對IL-1和TNF-a產(chǎn)生的抑制效應是其抗炎活性的關(guān)鍵所在,在細胞免疫中作為一種重要的負調(diào)節(jié)因子,能抑制炎癥細胞的活化,對抗炎癥因子引起的損害。IL-10對IBD的保護作用已經(jīng)被廣泛證實。在小鼠模型中,敲除IL-10基因可誘發(fā)由Thl細胞介導的類似于人類CD的自發(fā)性結(jié)腸炎。在各種動物試驗中,給予IL-10蛋白制品或分泌IL-10的基因工程菌如乳酸桿菌等可預防IBD或減輕已發(fā)生的腸道炎癥。 人的IL-4是分子量約20KD的糖蛋白,成熟的IL-4分子由129個氨基酸組成,編碼IL-4分子的基因位于第5號染色體上,由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。其基因長度約為10Kb,是已知的人的淋巴因子中最長的。在小鼠中,IL-4主要由激活的淋巴細胞合成,可以抑制其他促炎因子如IL-1、IL-6、IL-8及TNF-a產(chǎn)生,還可以誘導IL-1α的產(chǎn)生,提高IL-1ra/IL-1的比值,具有較強的抗炎功能,對維持腸道免疫起重要作用。作為Th0細胞向Th2細胞分化的主要誘導因子,IL-4可調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡,抑制Thl型炎癥性疾病。許多體內(nèi)外細胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)UC患者的IL-4分泌細胞數(shù)下降,IL-4mRNA的表達及蛋白分泌明顯減少。但是,另外一些研究卻發(fā)現(xiàn)IL-4也能通過上調(diào)IFN-γ、TNF-α的表達促進Thl型反應。由此可見,IL-4在細胞免疫中發(fā)揮的作用是復雜的,其在IBD中的作用機制尚未完全闡釋清楚。 IBD動物模型包括轉(zhuǎn)基因模型、免疫學模型和化學性炎癥模型。其中三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)誘導的化學性炎癥模型是實驗研究中常用的模型。TNBS是一種半抗原物質(zhì),多與乙醇合用造模。乙醇破壞腸黏膜屏障后,TNBS與結(jié)腸組織蛋白結(jié)合形成完全抗原,導致腸黏膜發(fā)生遲發(fā)性變態(tài)反應,從而造成腸黏膜的損傷。此模型可誘發(fā)Thl型免疫反應,類似人類CD。TNBS造模法雖然缺乏特征性急性期表現(xiàn),而且動物死亡率高,但操作簡單、經(jīng)濟實用、重現(xiàn)性好、造模時間短、病變持續(xù)時間較長,能體現(xiàn)急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程,是一種經(jīng)典的動物模型,適用于研究IBD的發(fā)病機制和篩選新的藥物靶點。 IBD傳統(tǒng)治療方法包括5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等,但是傳統(tǒng)藥物有效性和安全性均具有一定程度的局限性,且停藥后容易復發(fā),最終需要手術(shù)治療的患者比例較高,患者的生活質(zhì)量仍受到一定的影響。隨著對IBD發(fā)病機制研究的深入,生物制劑治療成為研究的新方向。如腫瘤壞死因子-α(TNF-a)在IBD的發(fā)病機制中是一個關(guān)鍵的細胞因子,在炎癥反應的起始和擴大中發(fā)揮重要的作用。在UC和CD患者的小腸粘膜中TNF-a含量明顯增加,而且與炎癥的活動性相關(guān)。英夫利昔(Infliximab,一種IgG1鼠/人嵌合型抗TNF-a單克隆抗體)是一種最有效的誘導和維持治療活動性和具有瘺管的克羅恩病的生物學制劑,而且是目前惟一被美國食品和藥物管理局(Food and drug administration, FDA)批準用于治療IBD的生物學制劑。然而,英夫利昔也存在免疫原性的限制,可導致輸液反應和降低療效。其不良反應還包括延遲的高血壓反應、藥物誘導的狼瘡、脫髓鞘、非霍奇金淋巴瘤、充血性心力衰竭和嚴重機會性感染。另外,腸道外給藥方式也不利于患者長期給藥,并且對UC療效不明顯。 基因治療通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使機體表達相關(guān)免疫保護蛋白質(zhì),從而下調(diào)致病的炎癥和免疫反應,上調(diào)保護性反應。局部給予經(jīng)包裝的質(zhì)粒、脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體均能將目的基因轉(zhuǎn)導至腸道黏膜并持續(xù)表達目的基因。上述載體中,以AAV載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導效率高,應用前景最廣闊。重組AAV(reconstructed AAV,rAAV)載體去除了所有編碼序列,只保留145bp的末端重復序列,不含任何病毒基因。但是腺病毒載體系統(tǒng)相對脂質(zhì)體等非病毒載體系統(tǒng),具有以下缺陷：有免疫原性；插入的目的片段大小受限制；當治療慢性疾病時,病毒基因可能整合至宿主基因組中,從而激活病毒導致感染風險。 基于以上的研究背景,本研究探討了脂質(zhì)體介導的小鼠白介素-4(murine interleukin-4, mIL-4)和小鼠白介素-10(nurine interleukin-4, mIL-10)轉(zhuǎn)基因治療對TNBS誘導的小鼠炎癥性腸病的作用。內(nèi)容包括： 1構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10。 2通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和聚丙烯酰胺凝膠電泳法(Western blotting)驗證pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10在體外的表達。 3構(gòu)建TNBS誘導的小鼠炎癥性腸病模型。 4經(jīng)腹腔注射給予脂質(zhì)體(LipofectAMINE2000reagent, Liposome)包裹的pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10或者pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10二者混合物,1周后處死小鼠,并取遠端結(jié)腸組織行HE染色病理學檢查、ELISA法檢測結(jié)腸粘膜中促炎因子IFN-γ表達、實時熒光定量PCR檢測TNF-a和IL-6的表達水平以觀察療效。方法 1.聚合酶鏈反應法(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴增iIL-4、mIL-10基因,連接真核表達載體pcDNA3.0,構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10。 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞,通過ELISA法或Western blotting方法驗證mIL-4和mIL-10在體外的表達。 3.用TNBS制備小鼠IBD模型：將70只雄性BALB／c小鼠隨機分為正常對照組(Vehicle組)和處理組：pcDNA3.0-mIL-4組(Liposome/IL-4)、pcDNA3.0-mIL-10組(Liposome/IL-10)、pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10組((Liposome/IL-4+IL-10))、TNBS組、pcDNA3.0組Liposome組,每組10只。處理組小鼠以100u1的TNBS乙醇溶液灌腸,正常對照組小鼠以100u1的50%乙醇灌腸。處理組小鼠于造模后24小時經(jīng)腹腔注射給予脂質(zhì)體包裹的pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10.pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10、pcDNA3.0或Liposome,于第7天處死。每日觀察各組小鼠疾病活動度、體重百分比變化。 4.取遠端結(jié)腸組織并切片行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE),用光學顯微鏡觀察小鼠結(jié)腸病理學變化。 5.酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠結(jié)腸黏膜中IFN-γ水平的變化。 6.實時熒光定量PCR (quantitive real time PRC,qRT-PCR)檢測各組小鼠結(jié)腸黏膜中TNF-α mRNA、IL-6mRNA表達的變化。 7.統(tǒng)計學處理：采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析：如果數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,以x±S表示,進行單向方差分析,若方差分析顯著時再行多重比較,方差齊性時行LSD法多重比較,方差不齊時行Dunnett's T3法多重比較；如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布,以中位數(shù)表示,進行多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗；疾病活動度、體重變化數(shù)據(jù)進行重復測量方差分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 1.PCR擴增出預期大小的目的片段mIL-4、mIL-10,與真核表達載體pcDNA3.0連接,構(gòu)成pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10重組質(zhì)粒；經(jīng)酶切鑒定、測序分析證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.ELISA法鑒定mIL-4在體外成功表達,Western blotting法鑒定mIL-10在體外成功表達。 3.經(jīng)腹腔注射給予脂質(zhì)體包裹的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10均可在小鼠體內(nèi)表達。4.Liposome/IL-4、Liposome/IL-10處理組小鼠疾病活動度指數(shù)(DAI)評分均低于TNBS組,Liposome/IL-4+IL-10處理組小鼠疾病活動度指數(shù)(disease activity index, DAI)評分與TNBS組接近。 5.各處理組小鼠的體重在第2、3天時下降最顯著,而Liposome/IL-4Liposome/IL-10處理組小鼠體重從第3天開始回復,至第7天大部分恢復正常；而Liposome/IL-4+IL-10處理組和TNBS組小鼠體重持續(xù)下降。 6. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10處理組小鼠結(jié)腸組織學評分均低于TNBS組(x2=37.118,P0.001),結(jié)腸腸壁結(jié)構(gòu)完整,結(jié)腸粘膜少量炎性細胞浸潤；TNBS模型組、Liposome/IL-4+IL-10處理組小鼠結(jié)腸粘膜上皮缺損,杯狀細胞減少,粘膜下層水腫,腸壁全層炎細胞浸潤。 7. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10、Liposome/IL-4+IL-10組IFN-γ濃度均低于TNBS組,但Liposome/IL-4+IL-10組IFN-γ濃度高于Liposome/IL-4組和Liposome/IL-10組(x2=34.148, P0.001). 8. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10、Liposome/IL-10-4+IL-10組與TNBS組小鼠相比,結(jié)腸黏膜TNF-a mRNA、IL-6mRNA的表達水平均下調(diào)(P0.05)。結(jié)論 本研究構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10探討了脂質(zhì)體介導的IL-4、IL-10或IL-4聯(lián)合IL-10轉(zhuǎn)基因治療對TNBS誘導的IBD模型的影響。通過研究得出以下結(jié)論： 1.重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10在體內(nèi)、體外均可表達。 2.IL-4和IL-10轉(zhuǎn)基因治療TNBS誘導的IBD疾病活動度和結(jié)腸炎癥減輕。IL-4聯(lián)合IL-10治療不能減緩IBD疾病活動度和減輕結(jié)腸炎癥。 3.IL-4和IL-10轉(zhuǎn)基因治療明顯下調(diào)促炎因子IFN-γ、TNF-a、IL-6的表達,而IL-4聯(lián)合IL-10治療可下調(diào)部分促炎因子的表達,但效果明顯弱于IL-4或IL-10單獨作用。 4.IL-4、IL-10單獨轉(zhuǎn)基因治療IBD有效,而聯(lián)合使用IL-4、IL-10療效甚微。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R574;R-332

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 肖梅;吳正祥;;炎癥性腸病的病因研究進展[J];安徽醫(yī)藥;2005年12期

2 趙杰;朱維銘;李寧;;益生菌、益生元、合生元與炎癥性腸病[J];腸外與腸內(nèi)營養(yǎng);2014年04期

3 王為;周國華;;細胞因子與炎癥性腸病[J];臨床軍醫(yī)雜志;2007年03期

4 汪圣毅;王玉琦;符偉國;劉康達;;腺病毒介導白細胞介素-10基因轉(zhuǎn)染抑制血管平滑肌細胞的增殖及機制[J];中國臨床醫(yī)學;2006年05期

5 牛韜;胡明;;微生物群結(jié)構(gòu)、人類健康和癌癥化學預防(英文)[J];化學進展;2013年09期

6 彭小青;李夏雨;王瑋;李楠;馬健;沈守榮;;Th1/Th2細胞炎性因子在大鼠潰瘍性結(jié)腸炎治療模型中的表達[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2013年10期

7 惠毅;閆曙光;李京濤;周永學;;大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型建立方法探討[J];遼寧中醫(yī)藥大學學報;2013年10期

8 張宏邈;趙令竹;谷松;盧健;;四逆散及其拆方對實驗性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-4的影響[J];遼寧中醫(yī)雜志;2015年05期

9 楊士偉;辛學知;劉鈞寧;李志;;美沙拉秦栓治療輕、中度遠端潰瘍性結(jié)腸炎的療效評價[J];臨床藥物治療雜志;2015年02期

10 Sachin B Ingle;Baban D Adgaonkar;Nawab P Jamadar;Saleha Siddiqui;Chitra R Hinge;;Crohn's disease with gastroduodenal involvement: Diagnostic approach[J];World Journal of Clinical Cases;2015年06期

相關(guān)會議論文 前1條

1 程曉蕾;陳宏;;Th17細胞與變態(tài)反應性疾病的研究現(xiàn)狀[A];第六次全國中西醫(yī)結(jié)合變態(tài)反應學術(shù)大會論文匯編[C];2013年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 姚君;攜帶hIL-10基因的雙歧桿菌治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的研究[D];暨南大學;2011年

2 汪圣毅;腺病毒介導hIL-10基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合IFN-γ抑制血管平滑肌細胞增殖及其機制的研究[D];復旦大學;2005年

3 趙穎;旋毛蟲干預實驗性炎癥性腸病的效應及其免疫學機制探討[D];吉林大學;2007年

4 王丹;潰瘍性結(jié)腸炎應用5-ASA前藥的療效、機制及β2GPⅠ在發(fā)病中的作用研究[D];吉林大學;2008年

5 王京;神經(jīng)介素U及其受體1在炎癥性腸病中的作用及其機制研究[D];山東大學;2013年

6 鄒穎;黃芩湯對TNBS誘導的結(jié)腸炎大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細胞平衡的影響[D];南方醫(yī)科大學;2012年

7 李文斌;IL-17A/G-CSF axis對于免疫細胞的調(diào)控及其在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

8 黃振;基于阻斷免疫細胞浸潤活化的炎癥性腸病治療策略研究[D];南京大學;2013年

9 付春玲;疏水性陽離子聚合物PP80介導的抗腫瘤基因治療[D];東北師范大學;2013年

10 董方聰;潰瘍性結(jié)腸炎和菌血癥的代謝組NMR研究[D];中國科學院研究生院（武漢物理與數(shù)學研究所）;2013年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 張善金;NF-κBp65反義寡核苷酸對TNBS誘導BALB/C小鼠慢性結(jié)腸炎腸道纖維化的影響[D];南昌大學;2011年

2 肖梅;核因子-κB、環(huán)氧合酶-2和單核細胞趨化蛋白-1在結(jié)腸炎模型鼠腸粘膜中的表達與關(guān)系[D];安徽醫(yī)科大學;2007年

3 陳鳳媛;骨橋蛋白在炎癥性腸病發(fā)病機制中作用的研究[D];復旦大學;2009年

4 彭小青;Th1/Th2細胞炎性因子在大鼠潰瘍性結(jié)腸炎治療模型中的表達研究[D];中南大學;2012年

5 韓曉霞;電針對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸道微生態(tài)的保護作用研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2012年

6 單佩英;潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群多樣性及炎癥細胞因子變化的研究[D];大連醫(yī)科大學;2012年

7 李琦;腹膜透析及其并發(fā)腹膜炎患者的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)研究[D];浙江大學;2013年

8 魏鋮;攜帶hIL-10基因的雙歧桿菌治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的機理[D];暨南大學;2013年

9 周俊峰;抵抗素樣分子β在胃癌中的表達及其意義[D];福建醫(yī)科大學;2013年

10 李為慧;RAGE、sRAGE在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達及臨床意義[D];安徽醫(yī)科大學;2013年

，

本文編號：2388536