【摘要】：研究背景和目的： 炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一種遺傳因素、環(huán)境因素和免疫因素共同參與的腸道慢性非特異性炎癥性疾病。包括克羅恩病(Crohn's disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC),呈間歇性反復(fù)發(fā)作。IBD在歐美的發(fā)病率高于發(fā)展中國家,但近年來我國的IBD發(fā)病率明顯上升。雖然目前IBD病因?qū)W和發(fā)病機制仍未明確,但越來越多的證據(jù)支持Th1/Th2型反應(yīng)失衡介導(dǎo)的免疫異常在炎癥性腸病發(fā)病中起重要作用。根據(jù)所分泌細(xì)胞因子和介導(dǎo)免疫功能的不同,CD4+T細(xì)胞可分為1型輔助性T細(xì)胞(Thl細(xì)胞)和2型輔助性T細(xì)胞(Th2細(xì)胞)兩型。Thl型細(xì)胞主要分泌干擾素-γ(interferon-γ,IFN-y)、白介素-2(interleukin-2,IL-2)和腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α),Th2型細(xì)胞分泌白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)和白介素-10(IL-10)。CD的免疫類型主要偏向于Th1型,而UC主要是Th2型疾病。 細(xì)胞因子分為促炎因子和抑炎因子。促炎因子和抑炎因子的失衡在炎癥性腸病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。促炎因子如白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、TNF-α和IFN-γ等由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌,參與細(xì)胞免疫；抑炎因子如IL-4、IL-5和IL-10等由T細(xì)胞分泌,參與體液免疫反應(yīng)。其中,IL-10和IL-4是最重要的兩種抑炎因子。 IL-10可由多種細(xì)胞產(chǎn)生,包括T細(xì)胞(CD4+和CD8+)、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。由1號染色體上的五個外顯子編碼。IL-10能抑制TNF-α、INF-γ、IL-6等促炎因子的產(chǎn)生。IL-10對IL-1和TNF-a產(chǎn)生的抑制效應(yīng)是其抗炎活性的關(guān)鍵所在,在細(xì)胞免疫中作為一種重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子,能抑制炎癥細(xì)胞的活化,對抗炎癥因子引起的損害。IL-10對IBD的保護(hù)作用已經(jīng)被廣泛證實。在小鼠模型中,敲除IL-10基因可誘發(fā)由Thl細(xì)胞介導(dǎo)的類似于人類CD的自發(fā)性結(jié)腸炎。在各種動物試驗中,給予IL-10蛋白制品或分泌IL-10的基因工程菌如乳酸桿菌等可預(yù)防IBD或減輕已發(fā)生的腸道炎癥。 人的IL-4是分子量約20KD的糖蛋白,成熟的IL-4分子由129個氨基酸組成,編碼IL-4分子的基因位于第5號染色體上,由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。其基因長度約為10Kb,是已知的人的淋巴因子中最長的。在小鼠中,IL-4主要由激活的淋巴細(xì)胞合成,可以抑制其他促炎因子如IL-1、IL-6、IL-8及TNF-a產(chǎn)生,還可以誘導(dǎo)IL-1α的產(chǎn)生,提高IL-1ra/IL-1的比值,具有較強的抗炎功能,對維持腸道免疫起重要作用。作為Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化的主要誘導(dǎo)因子,IL-4可調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡,抑制Thl型炎癥性疾病。許多體內(nèi)外細(xì)胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)UC患者的IL-4分泌細(xì)胞數(shù)下降,IL-4mRNA的表達(dá)及蛋白分泌明顯減少。但是,另外一些研究卻發(fā)現(xiàn)IL-4也能通過上調(diào)IFN-γ、TNF-α的表達(dá)促進(jìn)Thl型反應(yīng)。由此可見,IL-4在細(xì)胞免疫中發(fā)揮的作用是復(fù)雜的,其在IBD中的作用機制尚未完全闡釋清楚。 IBD動物模型包括轉(zhuǎn)基因模型、免疫學(xué)模型和化學(xué)性炎癥模型。其中三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的化學(xué)性炎癥模型是實驗研究中常用的模型。TNBS是一種半抗原物質(zhì),多與乙醇合用造模。乙醇破壞腸黏膜屏障后,TNBS與結(jié)腸組織蛋白結(jié)合形成完全抗原,導(dǎo)致腸黏膜發(fā)生遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng),從而造成腸黏膜的損傷。此模型可誘發(fā)Thl型免疫反應(yīng),類似人類CD。TNBS造模法雖然缺乏特征性急性期表現(xiàn),而且動物死亡率高,但操作簡單、經(jīng)濟(jì)實用、重現(xiàn)性好、造模時間短、病變持續(xù)時間較長,能體現(xiàn)急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程,是一種經(jīng)典的動物模型,適用于研究IBD的發(fā)病機制和篩選新的藥物靶點。 IBD傳統(tǒng)治療方法包括5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等,但是傳統(tǒng)藥物有效性和安全性均具有一定程度的局限性,且停藥后容易復(fù)發(fā),最終需要手術(shù)治療的患者比例較高,患者的生活質(zhì)量仍受到一定的影響。隨著對IBD發(fā)病機制研究的深入,生物制劑治療成為研究的新方向。如腫瘤壞死因子-α(TNF-a)在IBD的發(fā)病機制中是一個關(guān)鍵的細(xì)胞因子,在炎癥反應(yīng)的起始和擴(kuò)大中發(fā)揮重要的作用。在UC和CD患者的小腸粘膜中TNF-a含量明顯增加,而且與炎癥的活動性相關(guān)。英夫利昔(Infliximab,一種IgG1鼠/人嵌合型抗TNF-a單克隆抗體)是一種最有效的誘導(dǎo)和維持治療活動性和具有瘺管的克羅恩病的生物學(xué)制劑,而且是目前惟一被美國食品和藥物管理局(Food and drug administration, FDA)批準(zhǔn)用于治療IBD的生物學(xué)制劑。然而,英夫利昔也存在免疫原性的限制,可導(dǎo)致輸液反應(yīng)和降低療效。其不良反應(yīng)還包括延遲的高血壓反應(yīng)、藥物誘導(dǎo)的狼瘡、脫髓鞘、非霍奇金淋巴瘤、充血性心力衰竭和嚴(yán)重機會性感染。另外,腸道外給藥方式也不利于患者長期給藥,并且對UC療效不明顯。 基因治療通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使機體表達(dá)相關(guān)免疫保護(hù)蛋白質(zhì),從而下調(diào)致病的炎癥和免疫反應(yīng),上調(diào)保護(hù)性反應(yīng)。局部給予經(jīng)包裝的質(zhì)粒、脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體均能將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸道黏膜并持續(xù)表達(dá)目的基因。上述載體中,以AAV載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高,應(yīng)用前景最廣闊。重組AAV(reconstructed AAV,rAAV)載體去除了所有編碼序列,只保留145bp的末端重復(fù)序列,不含任何病毒基因。但是腺病毒載體系統(tǒng)相對脂質(zhì)體等非病毒載體系統(tǒng),具有以下缺陷：有免疫原性；插入的目的片段大小受限制；當(dāng)治療慢性疾病時,病毒基因可能整合至宿主基因組中,從而激活病毒導(dǎo)致感染風(fēng)險。 基于以上的研究背景,本研究探討了脂質(zhì)體介導(dǎo)的小鼠白介素-4(murine interleukin-4, mIL-4)和小鼠白介素-10(nurine interleukin-4, mIL-10)轉(zhuǎn)基因治療對TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病的作用。內(nèi)容包括： 1構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10。 2通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和聚丙烯酰胺凝膠電泳法(Western blotting)驗證pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10在體外的表達(dá)。 3構(gòu)建TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性腸病模型。 4經(jīng)腹腔注射給予脂質(zhì)體(LipofectAMINE2000reagent, Liposome)包裹的pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10或者pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10二者混合物,1周后處死小鼠,并取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織行HE染色病理學(xué)檢查、ELISA法檢測結(jié)腸粘膜中促炎因子IFN-γ表達(dá)、實時熒光定量PCR檢測TNF-a和IL-6的表達(dá)水平以觀察療效。方法 1.聚合酶鏈反應(yīng)法(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴(kuò)增iIL-4、mIL-10基因,連接真核表達(dá)載體pcDNA3.0,構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10。 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞,通過ELISA法或Western blotting方法驗證mIL-4和mIL-10在體外的表達(dá)。 3.用TNBS制備小鼠IBD模型：將70只雄性BALB／c小鼠隨機分為正常對照組(Vehicle組)和處理組：pcDNA3.0-mIL-4組(Liposome/IL-4)、pcDNA3.0-mIL-10組(Liposome/IL-10)、pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10組((Liposome/IL-4+IL-10))、TNBS組、pcDNA3.0組Liposome組,每組10只。處理組小鼠以100u1的TNBS乙醇溶液灌腸,正常對照組小鼠以100u1的50%乙醇灌腸。處理組小鼠于造模后24小時經(jīng)腹腔注射給予脂質(zhì)體包裹的pcDNA3.0-mIL-4、pcDNA3.0-mIL-10.pcDNA3.0-mIL-4+pcDNA3.0-mIL-10、pcDNA3.0或Liposome,于第7天處死。每日觀察各組小鼠疾病活動度、體重百分比變化。 4.取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織并切片行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE),用光學(xué)顯微鏡觀察小鼠結(jié)腸病理學(xué)變化。 5.酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠結(jié)腸黏膜中IFN-γ水平的變化。 6.實時熒光定量PCR (quantitive real time PRC,qRT-PCR)檢測各組小鼠結(jié)腸黏膜中TNF-α mRNA、IL-6mRNA表達(dá)的變化。 7.統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析：如果數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,以x±S表示,進(jìn)行單向方差分析,若方差分析顯著時再行多重比較,方差齊性時行LSD法多重比較,方差不齊時行Dunnett's T3法多重比較；如果數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布,以中位數(shù)表示,進(jìn)行多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗；疾病活動度、體重變化數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量方差分析。P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1.PCR擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的片段mIL-4、mIL-10,與真核表達(dá)載體pcDNA3.0連接,構(gòu)成pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10重組質(zhì)粒；經(jīng)酶切鑒定、測序分析證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.ELISA法鑒定mIL-4在體外成功表達(dá),Western blotting法鑒定mIL-10在體外成功表達(dá)。 3.經(jīng)腹腔注射給予脂質(zhì)體包裹的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10均可在小鼠體內(nèi)表達(dá)。4.Liposome/IL-4、Liposome/IL-10處理組小鼠疾病活動度指數(shù)(DAI)評分均低于TNBS組,Liposome/IL-4+IL-10處理組小鼠疾病活動度指數(shù)(disease activity index, DAI)評分與TNBS組接近。 5.各處理組小鼠的體重在第2、3天時下降最顯著,而Liposome/IL-4Liposome/IL-10處理組小鼠體重從第3天開始回復(fù),至第7天大部分恢復(fù)正常；而Liposome/IL-4+IL-10處理組和TNBS組小鼠體重持續(xù)下降。 6. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10處理組小鼠結(jié)腸組織學(xué)評分均低于TNBS組(x2=37.118,P0.001),結(jié)腸腸壁結(jié)構(gòu)完整,結(jié)腸粘膜少量炎性細(xì)胞浸潤；TNBS模型組、Liposome/IL-4+IL-10處理組小鼠結(jié)腸粘膜上皮缺損,杯狀細(xì)胞減少,粘膜下層水腫,腸壁全層炎細(xì)胞浸潤。 7. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10、Liposome/IL-4+IL-10組IFN-γ濃度均低于TNBS組,但Liposome/IL-4+IL-10組IFN-γ濃度高于Liposome/IL-4組和Liposome/IL-10組(x2=34.148, P0.001). 8. Liposome/IL-4、Liposome/IL-10、Liposome/IL-10-4+IL-10組與TNBS組小鼠相比,結(jié)腸黏膜TNF-a mRNA、IL-6mRNA的表達(dá)水平均下調(diào)(P0.05)。結(jié)論 本研究構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10探討了脂質(zhì)體介導(dǎo)的IL-4、IL-10或IL-4聯(lián)合IL-10轉(zhuǎn)基因治療對TNBS誘導(dǎo)的IBD模型的影響。通過研究得出以下結(jié)論： 1.重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-mIL-4和pcDNA3.0-mIL-10在體內(nèi)、體外均可表達(dá)。 2.IL-4和IL-10轉(zhuǎn)基因治療TNBS誘導(dǎo)的IBD疾病活動度和結(jié)腸炎癥減輕。IL-4聯(lián)合IL-10治療不能減緩IBD疾病活動度和減輕結(jié)腸炎癥。 3.IL-4和IL-10轉(zhuǎn)基因治療明顯下調(diào)促炎因子IFN-γ、TNF-a、IL-6的表達(dá),而IL-4聯(lián)合IL-10治療可下調(diào)部分促炎因子的表達(dá),但效果明顯弱于IL-4或IL-10單獨作用。 4.IL-4、IL-10單獨轉(zhuǎn)基因治療IBD有效,而聯(lián)合使用IL-4、IL-10療效甚微。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R574;R-332

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2388536