【摘要】：呼吸道病毒是引發(fā)嬰幼兒急性呼吸道感染疾病的主要病原體,目前仍有60%的小兒呼吸道疾病病理未闡明。2005年瑞典科學(xué)家Allander從患呼吸道疾病的嬰幼兒感染樣本中分離到一種新病毒,命名為人類(lèi)博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)。HBoV為單鏈、無(wú)包膜DNA病毒,屬于細(xì)小病毒科,博卡病毒屬。最近,在胃腸道疾病患者的糞便中又發(fā)現(xiàn)了三種不同基因型的人類(lèi)博卡病毒HBoV2、HBoV3和HBoV4。目前,由于未分離得到HBoV病毒粒子,感染性克隆的構(gòu)建又受阻于難以獲得病毒基因組末端回文序列(ITR),因此,對(duì)人類(lèi)博卡病毒的研究多局限于流行病學(xué)方面,而有關(guān)病毒致病機(jī)制的研究報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)采集患有呼吸道疾病嬰幼兒痰液樣本,從中鑒定出人類(lèi)博卡病毒(HBoV1),構(gòu)建病毒基因組中間大片段克隆(缺少I(mǎi)TR),并獲得包含HBoV1基因組的重組桿狀病毒。以構(gòu)建的克隆及重組桿狀病毒為工具,對(duì)該病毒的轉(zhuǎn)錄機(jī)制、蛋白表達(dá)、啟動(dòng)子活性及病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)該啟動(dòng)子的調(diào)控作用進(jìn)行分析。研究結(jié)果為深入揭示人類(lèi)博卡病毒感染途徑和致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ),將促進(jìn)病毒性呼吸道感染的治療和預(yù)防。本論文的研究主要取得了以下幾個(gè)方面的進(jìn)展： 采用PCR擴(kuò)增方法,以人類(lèi)博卡病毒的NP1基因作為目標(biāo)基因,對(duì)2007年10月-2009年3月收集的941例下呼吸道感染患者的痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。941份標(biāo)本中共檢測(cè)到33份HBoV陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物,陽(yáng)性率為3.51%(33/941),且在所檢出的陽(yáng)性樣品中,1歲以下嬰幼兒樣品共有24份,占陽(yáng)性樣72.7%,表明人類(lèi)博卡病毒的敏感人群為1周歲以下嬰幼兒。以檢測(cè)的陽(yáng)性樣本DNA為模板,通過(guò)分子生物學(xué)方法,構(gòu)建了含有HBoV中間大片段基因組克隆,命名為WHL-1,基因組序列比對(duì)為HBoV1型,序列全長(zhǎng)5299bp (GenBank Acession NO. GU139423)。運(yùn)用BLAST分析該病毒株與GenBank中HBoV1基因的同源性,結(jié)果顯示W(wǎng)HL-1病毒株與目前報(bào)道的其他幾株人類(lèi)博卡病毒有高度同源的基因組序列。目前為止還未得到病毒基因組的末端回文序列。 PCR擴(kuò)增人類(lèi)博卡病毒左端唯一啟動(dòng)子區(qū),分別構(gòu)建病毒啟動(dòng)子增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)/熒光素酶報(bào)告基因重組載體：pGL3-pBoV-EGFP/pGL3-Basic-pBoV,轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,通過(guò)檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)和熒光素酶活性定性并定量研究人類(lèi)博卡病毒啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的活性。結(jié)果顯示,啟動(dòng)子在試驗(yàn)細(xì)胞中都具有活性,且比強(qiáng)啟動(dòng)子巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(Cytomegalovirus,CMV)活性更高,在293T細(xì)胞中HBoV1啟動(dòng)子活性是CMV的4-5倍。將252bp啟動(dòng)子序列截短成7段,克隆到pGL3-Basic載體中,通過(guò)測(cè)定熒光素酶報(bào)告基因發(fā)光值檢測(cè)各片段的活性,我們發(fā)現(xiàn)1-95nt序列對(duì)啟動(dòng)子活性無(wú)影響,而96-145nt區(qū)域?qū)?dòng)子活性有很大影響,推測(cè)該區(qū)段為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。通過(guò)共轉(zhuǎn)染試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在被轉(zhuǎn)染的293T和HeLa細(xì)胞中,病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1對(duì)HBoV1啟動(dòng)子具有反式激活作用,熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)啟動(dòng)子活性增強(qiáng)2-3倍,推測(cè)NS1蛋白在病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮作用。 通過(guò)RT-PCR及RACE實(shí)驗(yàn),我們?cè)趐WHL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中檢測(cè)到NP1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄子的起始位點(diǎn)都位于186nt處,在mRNA1中,只發(fā)生一次剪接(供體位點(diǎn)在241nt處,受體位點(diǎn)在2236nt處),在mRNA2中,發(fā)生兩次剪接(第一次位于241nt、2044nt處,第二次位于2164nt、2236nt處)：發(fā)現(xiàn)兩個(gè)不同的NP1mRNA多聚腺苷酸位點(diǎn),分別位于3233nt和3389nt。Southern blot試驗(yàn)顯示,pWHL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未發(fā)生病毒DNA復(fù)制,進(jìn)一步證明ITR結(jié)構(gòu)對(duì)病毒DNA復(fù)制是必需的,且HBoVl啟動(dòng)子為早期強(qiáng)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子在試驗(yàn)細(xì)胞中啟動(dòng)病毒NP1基因轉(zhuǎn)錄并翻譯,產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白NP1定位在細(xì)胞核中。 利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了包含HBoVl中間大片段的重組桿狀病毒Bac-HBoVl及包含啟動(dòng)子-EGFP片段的重組桿狀病毒Bac-Bov-EGFP。通過(guò)流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)的多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,重組桿狀病毒Bac-Bov-EGFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比重組質(zhì)粒pGL-pboca-EGFP的轉(zhuǎn)染效率高,如相對(duì)轉(zhuǎn)染效率較低的A-549細(xì)胞,重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率達(dá)到50%-60%。由于操作過(guò)程中不需要使用昂貴且對(duì)細(xì)胞有毒性的轉(zhuǎn)染試劑,又可通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞擴(kuò)增得到大量重組桿狀病毒粒子,該系統(tǒng)為轉(zhuǎn)染效率較低細(xì)胞接納外源基因提供更為優(yōu)化的平臺(tái)。同時(shí),構(gòu)建的重組桿狀病毒Bac-HBoV1轉(zhuǎn)導(dǎo)293T、HeLa和A549細(xì)胞,都可檢測(cè)到HBoVl-NP1基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),與pWHL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)果一致,進(jìn)一步證明該系統(tǒng)的可行性及優(yōu)越性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R373;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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1 瞿小旺;漆正宇;段招軍;劉勁松;劉巧突;劉文培;黃燦平;謝志萍;彭夫望;高寒春;鄭麗舒;侯云德;;兒童急性呼吸道博卡病毒感染[J];病毒學(xué)報(bào);2006年02期

2 林峰;曾愛(ài)平;楊恩;林海燕;鄭昌華;陳弘;李樺;李旭陽(yáng);郁明素;楊寧敏;金大智;余光創(chuàng);伯曉晨;文思遠(yuǎn);王升啟;;WLL-1株博卡病毒(Bocavirus)全基因組序列分析[J];病毒學(xué)報(bào);2007年01期

3 曾愛(ài)平;林峰;楊寧敏;林海燕;鄭昌華;李樺;陳弘;鄭敏巧;吳鋒;楊恩;金大智;文思遠(yuǎn);;熒光定量PCR方法檢測(cè)兒童下呼吸道感染的人博卡病毒[J];浙江檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2006年04期

4 林峰;曾愛(ài)平;楊恩;林海燕;鄭昌華;陳弘;李樺;李旭陽(yáng);郁明素;楊寧敏;金大智;余光創(chuàng);伯曉晨;文思遠(yuǎn);王升啟;;WLL-1株博卡病毒(Bocavirus)基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析[J];浙江檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2007年01期

5 謝淑霞;陸學(xué)東;林廣裕;莊婉莉;林創(chuàng)興;周仁彬;周曉華;馬廉;;人類(lèi)博卡病毒感染所致細(xì)支氣管炎的臨床特點(diǎn)[J];實(shí)用兒科臨床雜志;2010年04期

6 趙林清;錢(qián)淵;朱汝南;鄧潔;王芳;Li Yan;;北京地區(qū)嬰幼兒急性呼吸道感染與新近報(bào)道的人細(xì)小病毒相關(guān)性的初步研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2006年05期

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本文編號(hào)：2387043