【摘要】：目的：由于間充質(zhì)干細胞（MSCs）對于人類疾病治療具有潛在的、可預(yù)期的重大影響，近年來，許多學者致力于應(yīng)用MSCs治療疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，其中，以臍血間充質(zhì)干細胞（UCB-MSCs）的研究為主導。目前，UCB-MSCs已被成功誘導分化為多種組織細胞，不少學者也對UCB-MSCs的分離純化技術(shù)進行了探索，對其培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件進行了諸多的改良和優(yōu)化，但在不同洗滌離心力對UCB-MSCs純化的影響方面卻鮮見報道。筆者在進行UCB-MSCs培養(yǎng)時，反復使用大部分學者采用[1]的1500r/min離心10min（r=15cm，相對離心場RCF=378g）洗滌技術(shù)，始終未能獲得滿意的細胞貼壁及生長結(jié)果，分析認為是由于該洗滌方法所得到的細胞純度不高所致。由于不同離心力洗滌對于干細胞純化的影響舉足輕重，故有必要對其進行深入的研究。本實驗在其它實驗條件不變的基礎(chǔ)上，首先將臍血離心并有效分層，然后使用不同離心力洗滌，觀察對比不同洗滌離心力對UCB-MSCs純化的影響，以期尋找出更有利于干細胞純化的適宜洗滌離心技術(shù)，為UCB-MSCs培養(yǎng)提供更好的基礎(chǔ)條件。方法：選擇滿足UCB-MSCs采集適應(yīng)癥的孕婦8名，無菌采集臍血約40ml。首先以1:1比例用0.9%生理鹽水將臍血稀釋，然后按照1:1比例將稀釋后臍血緩緩加入淋巴細胞分離液（1.077g/ml）中，，2000r/min離心20min（671g），將臍血有效分層。輕輕吸取中間白膜層約30ml，添加0.9%生理鹽水至50ml后混勻，將其平均分為5份，每份10ml，分別以1500r/min離心10min（378g）、1300r/min離心10mi（n284g）、1200r/min離心10min（242g）、1000r/min離心10min（168g）、800r/min離心10min（107g），洗滌后均棄上清液，余細胞沉淀約0.5ml，加入L-DMEM-10%胎牛血清-慶大霉素培養(yǎng)基至10ml，混勻后分別接種于T25培養(yǎng)瓶，倒置相差顯微鏡下觀察（放大倍數(shù)10×20），選取混雜物質(zhì)數(shù)量居中的視野，對比每組混雜物質(zhì)的差異并行圖像采集，使用多項目自動血球分析裝置(XT-1800i)分析每份細胞懸液，記錄其單個核細胞（MNCs）密度（10~9/L）、紅細胞（RBCs）密度（10~9/L）、血小板（PLT）密度（10~9/L）、MNCs率（%），使用SPSS15.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，并繪制曲線圖。另外，移液槍吸取每份細胞懸液一滴涂片，行瑞氏染色，于油鏡下觀察雜質(zhì)情況并采集圖像。在細胞接種后第7天棄全部培養(yǎng)液，倒置相差顯微鏡下觀察，于各接種瓶中選取貼壁細胞數(shù)量居中的的視野5個，分別計數(shù)后行方差分析，并觀察對比梭狀細胞數(shù)。細胞接種后第14天，分別觀察每瓶細胞生長情況，選取生長情況居中的視野采集圖像。結(jié)果：1、比較不同離心力洗滌后接種當時在倒置相差顯微鏡下觀察到的情況，1500r/min洗滌、1300r/min洗滌接種瓶中除大量細胞外，可見大量混雜物質(zhì)，而1200r/min洗滌、1000r/min洗滌、800r/min洗滌接種瓶中除大量細胞外，混雜物質(zhì)明顯低于前兩者，800r/min洗滌接種瓶尤為顯著，將細胞懸液涂片行瑞氏染色后于油鏡下觀察（放大倍數(shù)10×1000），結(jié)果同倒置相差顯微鏡下觀察。2、將不同離心力洗滌后所得的MNCs密度（10~9/L）、RBCs密度（10~9/L）、PLT密度（10~9/L）、MNCs率（%）繪制成曲線圖，并行方差分析，其中MNCs密度（10~9/L）隨洗滌離心力降低有降低的趨勢、MNCs率（%）隨洗滌離心力降低有升高的趨勢，但二者的差別均不具有統(tǒng)計學意義（P0.05），PLT密度（10~9/L）、RBCs密度（10~9/L）隨洗滌離心力降低有降低的趨勢，其數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。3、細胞接種后第7天，于各接種瓶中選取貼壁細胞數(shù)量居中的的視野5個，分別計數(shù)后行方差分析，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察對比梭狀細胞數(shù)，800r/min洗滌的各接種瓶中，梭狀細胞數(shù)≥5個/視野的約有5-8個視野，1200r/min洗滌、1000r/min洗滌的各接種瓶中約有1-3個，1500r/min洗滌、1300r/min洗滌的各接種瓶中無滿足條件的視野。4、接種14天后倒置相差顯微鏡下觀察，800r/min洗滌的接種瓶中細胞生長情況相對最佳，2-5個視野下可見梭狀細胞融合抱團生長（抱團細胞數(shù)≥7個/視野），其余接種瓶從未見抱團生長情況，且細胞趨于死亡。結(jié)論：1.在使用淋巴細胞分離液（1.077g/ml）進行密度梯度離心法分離提純UCB-MSCs時，目前普遍采用的1500r/min離心10min（r=15cm，相對離心場RCF=378g）洗滌法所獲得的細胞純度不高，其中含大量混雜物質(zhì)，不利于UCB-MSCs貼壁、生長和分化，低離心力洗滌可使UCB-MSCs純度大大提高，利于UCB-MSCs貼壁和生長、分化，800r/min離心10min洗滌效果最佳；2、在使用淋巴細胞分離液進行密度梯度離心法分離提純UCB-MSCs時，RBCs殘余量對UCB-MSCs貼壁的影響遠遠低于PLT殘余量對其的影響，PLT殘余量可能才是影響UCB-MSCs貼壁的最主要因素，在洗滌細胞時應(yīng)著力去除。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2377890