【摘要】：背景與目的：1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate,S1P)是由鞘氨醇激酶1/2(sphingosine kinase1/2，SphK1/2)磷酸化鞘氨醇而合成。血管內(nèi)皮細(xì)胞，，紅細(xì)胞和血小板等是血液S1P的主要來源。脂蛋白是S1P在血漿中的主要結(jié)合載體，而絕大多數(shù)與高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)結(jié)合。HDL結(jié)合的S1P(HDL-S1P)也賦予HDL很多生物學(xué)功能，如抗血栓，保護(hù)內(nèi)皮功能和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用。而S1P釋放到細(xì)胞外通常受到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的刺激。載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoproteinA-Ⅰ, apoA-Ⅰ)與ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(ATP-binding cassette A1, ABCA1)的結(jié)合是HDL生成的起始過程，也是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的限速步驟。ApoA-Ⅰ也能結(jié)合清道夫受體B類Ⅰ型(scavenger receptor class B type Ⅰ，SR-BI)進(jìn)行膽固醇和磷脂的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)。ApoA-Ⅰ除轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇外，還可轉(zhuǎn)運(yùn)其他磷脂成分。S1P即是一種信號(hào)鞘磷脂，賦予HDL諸多重要作用。作為HDL的主要載脂蛋白，apoA-Ⅰ是否能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞S1P釋放，及其受體信號(hào)機(jī)制如何是本實(shí)驗(yàn)的研究目的。 方法：以apoA-Ⅰ不同時(shí)間和不同濃度處理培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs)。轉(zhuǎn)染SphK，ABCA1和SR-B1siRNA48小時(shí)后，20μg/ml apoA-Ⅰ孵育5分鐘。HUVECs分別預(yù)孵育N,N-Dimethylsphingosine(SphK1抑制劑)、U0126(ERK1/2抑制劑)、glybenclamide (ABCA1抑制劑)、BLT-1(SR-BI抑制劑)、AG490(JAK2抑制劑)、PP2(Src抑制劑)或PTX (G蛋白抑制劑)后，20μg/mlapoA-Ⅰ或1μM S1P孵育5分鐘。HUVECs預(yù)孵育glybenclamide后，20μg/ml apoA-Ⅰ處理10分鐘，5分鐘時(shí)額外處理SEW2871(S1PR1激動(dòng)劑)五分鐘。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)基S1P濃度。免疫印跡方法(Western blot，WB)檢測(cè)ERK1/2磷酸化水平。 結(jié)果：ApoA-Ⅰ促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞S1P釋放，在5分鐘至10分鐘之間達(dá)到峰值之后緩慢下降。apoA-Ⅰ能增加細(xì)胞內(nèi)S1P水平，1至3分鐘明顯升高，而后下降。SphK1的抑制劑或siRNA均減少apoA-Ⅰ誘導(dǎo)的S1P釋放。apoA-Ⅰ能激活內(nèi)皮細(xì)胞ERK1/2磷酸化，且ERK1/2抑制劑減少apoA-Ⅰ誘導(dǎo)的S1P釋放。ABCA1和SR-B-Ⅰ抑制劑或siRNA均能減少apoA-Ⅰ誘導(dǎo)的S1P釋放和ERK1/2磷酸化水平。但是，JAK2或Src抑制并不能減少apoA-Ⅰ誘導(dǎo)的S1P釋放和ERK1/2磷酸化水平。ABCA1，SR-B-Ⅰ抑制并不能減少S1P誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，而S1PR1/3抑制劑能減少S1P誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化。在ABCA1被抑制后，S1PR1激動(dòng)劑能增加細(xì)胞內(nèi)S1P水平，但不能明顯增加apoA-Ⅰ誘導(dǎo)的S1P釋放。 結(jié)論: 1. ApoA-Ⅰ能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞S1P釋放增加。 2. ApoA-Ⅰ通過內(nèi)皮細(xì)胞釋放的S1P，激活S1PR1/3-ERK1/2-SphK1途徑間接增加細(xì)胞內(nèi)S1P水平。 3. ApoA-Ⅰ介導(dǎo)的S1P釋放依賴于ABCA1和SR-B-Ⅰ受體。 4.推測(cè)S1PR1/3-ERK1/2-SphK1信號(hào)通路為apoA-Ⅰ介導(dǎo)的S1P釋放提供了正反饋途徑。
[Abstract]:Background & AIM: 1-sphingosine phosphate (sphingosine1-phosphate,S1P) is synthesized from sphingosine kinase 1 / 2 (sphingosine kinase1/2,SphK1/2) phosphorylated sphingosine. Vascular endothelial cells, red blood cells and platelets are the main sources of blood S 1 P. Lipoprotein is the major binding carrier of S1P in plasma, and most of them bind to high density lipoprotein (high density lipoprotein, HDL). S1P (HDL-S1P), which binds to HDL, also endows HDL with many biological functions, such as antithrombotic. Protect endothelial function and anti-atherosclerosis and so on. The release of S 1 P out of cells is usually stimulated by intracellular or extracellular stimulation. The binding of apolipoproteinA- 鈪

本文編號(hào)：2377062