發(fā)布時間：2018-12-09 09:56

【摘要】：DNA螺旋酶是原核生物細(xì)胞存活所必須的基礎(chǔ)酶類,是很多抗癌藥物(喹諾酮類)和抗生素藥物(新生霉素等)的天然作用靶標(biāo),在結(jié)核病防治中的有非常重要的作用。近年來螺旋酶在探討基本生命活動和開發(fā)設(shè)計新型藥物等方面成為研究熱點。 DNA螺旋酶是由A、B亞基共同組成的二源四聚體,目前關(guān)于結(jié)核分枝桿菌螺旋酶GyrA與GyrB相互作用研究并不深入,兩亞基之間究竟以何種方式重組而具有全酶活性,其機理完全不清楚。本實驗室已鑒定出結(jié)核分枝桿菌螺旋酶GyrB的Toprim結(jié)構(gòu)域是與GyrA相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。在此基礎(chǔ)上,本課題計劃構(gòu)建GyrB系列缺失突變體,利用酵母雙雜交、SPR儀檢測等技術(shù)分析其與GyrA之間的相互作用,確定GyrB與GyrA相互作用的核心區(qū)域,為探明螺旋酶催化機理提供基礎(chǔ),為闡明螺旋酶在結(jié)核分枝桿菌生命活動中的調(diào)控功能以及結(jié)核病新藥藥物靶標(biāo)的篩選開發(fā)提供依據(jù),并促進(jìn)結(jié)核病的防治。 本課題的主要研究結(jié)果為： 1、根據(jù)公布的gyrB基因序列,擴增突變體片段gyrB1-518、gyrB1-531、gyrB1-550、gyrB△531-550、gyrB△548-564；將擴增的的突變體基因構(gòu)建的相應(yīng)的表達(dá)載體pET28a和酵母載體pGADT7上；在GyrB1-564基礎(chǔ)上繼續(xù)構(gòu)建GyrB1-550,GyrB1-531, GyrB1-518突變體,并表達(dá)純化突變體蛋白質(zhì)； 2、酵母雙雜交、SPR等實驗結(jié)果證明：缺失C端的GyrB不能與GyrA相互作用,說明GyrB-CTD是其與GyrA相互作用的必需功能結(jié)構(gòu)域。 3、構(gòu)建α螺旋缺失突變體GyrB△531-550,酵母雙雜交等實驗結(jié)果顯示,531-550aaα螺旋的缺失導(dǎo)致GyrB與GyrA之間喪失相互作用活性,α螺旋531-550aa可能是GyrB與GyrA相互作用的一個核心區(qū)域。α螺旋531-550aa可能對GyrB二聚體的形成具有重要的意義。 4、構(gòu)建無規(guī)則卷曲缺失突變體GyrB△548-564,酵母雙雜交等實驗結(jié)果顯示,548-564aa短肽缺失導(dǎo)致GyrB與GyrA之間相互作用活性減弱,548-564aa短肽可能起到空間上支持Toprimα/β構(gòu)象的重要作用,并有可能與GyrB上其他功能域配合發(fā)揮作用。
[Abstract]:DNA helicase is the basic enzyme necessary for the survival of prokaryotes and is the natural target of many anticancer drugs (quinolones) and antibiotics (neomycin etc.) and plays a very important role in the prevention and treatment of tuberculosis. In recent years, helicase has become a hotspot in the research of basic life activities and the development and design of new drugs. DNA helicase is a dimeric dimer composed of subunits of DNA B. At present, the interaction between GyrA and GyrB of Mycobacterium tuberculosis is not deeply studied, and the way in which the two subunits are recombined to have the whole enzyme activity. The mechanism is completely unclear. The Toprim domain of Mycobacterium tuberculosis helicase GyrB has been identified as the key region of interaction with GyrA in our laboratory. On this basis, we plan to construct a series of GyrB deletion mutants, analyze the interaction between GyrB and GyrA by yeast two-hybrid and SPR detection, and determine the core region of the interaction between GyrB and GyrA. It provides the basis for the study of the catalytic mechanism of helicase, the regulation function of the helicase in the life activities of Mycobacterium tuberculosis and the screening and development of new drug targets for tuberculosis, and promotes the prevention and treatment of tuberculosis. The main results of this study are as follows: 1. According to the published gyrB gene sequence, the amplified mutant gyrB1-518,gyrB1-531,gyrB1-550,gyrB 531-550 gyrB 548-564; The corresponding expression vector pET28a and yeast vector pGADT7 were constructed from the amplified mutant gene, and the GyrB1-550,GyrB1-531, GyrB1-518 mutant was constructed on the basis of GyrB1-564, and the protein of the mutant was expressed and purified. 2. The results of yeast two-hybrid and SPR showed that the missing C-terminal GyrB could not interact with GyrA, indicating that GyrB-CTD was the necessary functional domain for the interaction between GyrB-CTD and GyrA. 3. The construction of 偽 -helix deletion mutant GyrB 531-550 and yeast two-hybrid experiments showed that the deletion of 531-550aa 偽 helix resulted in the loss of interaction activity between GyrB and GyrA. 偽 helix 531-550aa may be a core region of the interaction between GyrB and GyrA, and 偽 helix 531-550aa may play an important role in the formation of GyrB dimer. 4. GyrB 548-564, an irregular crimp deletion mutant, was constructed. The results of yeast two-hybrid experiments showed that the deletion of 548-564aa short peptide resulted in a decrease in the interaction activity between GyrB and GyrA. 548-564aa short peptides may play an important role in spatially supporting the conformation of Toprim 偽 / 尾 and may interact with other functional domains on GyrB.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

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本文編號：2369193