【摘要】：遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種短桿狀革蘭氏陰性致病菌,能造成多種淡、海水魚類的系統(tǒng)性出血敗血癥。E. tarda還是一種重要的人畜共患病原菌,是愛德華氏菌屬中唯一感染人類的成員。在感染過程中,E. tarda能以胞內(nèi)寄生模式定植于宿主重要器官,造成宿主表皮潰爛、膿腫、腸道組織腐敗,最終爆發(fā)形成愛德華氏菌病。目前,世界各地都有魚類感染E. tarda的病例報道,造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的嚴重經(jīng)濟損失。本實驗室最新公布的E. tarda基因組測序信息揭示了該病原菌廣泛宿主適應(yīng),侵染及毒力等方面的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。本課題基于對E. tarda毒性分離株EIB202在動物、細胞模型中致病力的綜合分析,初步篩選獲得與細菌雙組分系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)相關(guān)的減毒疫苗候選靶位。在此基礎(chǔ)上,鑒定了EIB202毒性因子T6SS、TTSS和溶血素在致病過程中的作用,揭示了雙組分系統(tǒng)EsrA-EsrB介導(dǎo)的外界環(huán)境條件對細菌T6SS和溶血素的調(diào)控機制,探索了新型跨界群體感應(yīng)系統(tǒng)QseB-QseC對E. tarda菌體表面結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的廣宿主適應(yīng)性及體內(nèi)生存的調(diào)控作用,初步總結(jié)繪制了E. tarda的毒性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 本研究首先研究了E. tarda EIB202的致病特性發(fā)現(xiàn)實驗室條件下E. tarda EIB202對斑馬魚、牙鲆的半致死劑量相近,而且受感染宿主發(fā)病特征典型。細胞模型考察發(fā)現(xiàn),E. tarda EIB202具有顯著的上皮細胞感染能力,能通過內(nèi)化作用進入宿主細胞,其內(nèi)化比率較E. coli高22倍。此外,E. tarda EIB202還能利用Ⅲ型和Ⅵ型分泌系統(tǒng)對抗macrophage J774a的天然殺傷作用,在胞內(nèi)維持穩(wěn)定增殖,其胞內(nèi)增殖率較E. coli高9倍,揭示EIB202造成動物感染和細胞損傷的致病特征,初步證明由分泌系統(tǒng)以及雙組分系統(tǒng)組成的毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在E. tarda致病過程中的重要作用。 基于對E. tarda EIB202毒力特征的初步認識以及其全基因組信息,本研究選擇10個涉及毒力、代謝、調(diào)控、分泌系統(tǒng)、壓力應(yīng)激、群體感應(yīng)等相關(guān)的靶位基因,利用無標記框內(nèi)缺失技術(shù)構(gòu)建獲得缺失突變菌株AaroC、AesrB、AtorR、AkatB、WED、AmgtB、AethA、AsodC、AclpB和AedwR。經(jīng)累積致死率和初步免疫保護評估發(fā)現(xiàn),具有典型營養(yǎng)缺陷型特征的AaroC菌株減毒效果明顯,并能激起斑馬魚免疫反應(yīng),達到68%的免疫保護效果。此外,AesrB和WED菌株也具有良好的減毒效果,在斑馬魚免疫中達到80%和81%的免疫保護效果。 本研究考察了E. tarda毒力元件的生理功能并建立其毒力相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Ⅵ型分泌系統(tǒng)是細菌中分布較廣、毒力特征明顯的重要分泌組件。本研究比較了不同分離菌株中的E. tarda VI型分泌系統(tǒng)特有元件EvpP的分布,發(fā)現(xiàn)鰻源Aeromonas hydrophila 0865攜帶有與E. tarda的evpP基因相似度很高的編碼序列,暗示evpP基因甚至Ⅵ型分泌系統(tǒng)可能通過水平轉(zhuǎn)移在不同菌株間傳遞。此外,利用流式細胞術(shù)進行evpP啟動子活性分析,進一步揭示雙組分系統(tǒng)EsrA-EsrB能激活EvpP及T6SS元件表達,而Fur蛋白介導(dǎo)的鐵離子調(diào)控則抑制了EvpP及T6SS元件的表達�；趧游锖图毎Ｐ�,進一步考察了EvpP元件在E. tarda宿主感染中的作用,發(fā)現(xiàn)evpP基因缺失菌株喪失體內(nèi)特別是免疫器官內(nèi)的寄生增殖能力,而且顯著削弱了內(nèi)化進入EPC細胞的能力,證明EvpP在E. tarda的宿主感染機制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,并受到雙組分系統(tǒng)EsrA-EsrB和Fur蛋白的調(diào)控。 雙組分系統(tǒng)是細菌響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激并控制基因表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),在細菌致病機制中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),阻斷E. tarda雙組分系統(tǒng)EsrA-EsrB效應(yīng)元件EsrB,產(chǎn)生了良好的減毒效果,卻增強了菌株對宿主和細胞的侵染能力。通過比較不同組分的細胞毒性發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清具有較高的細胞毒性。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)AesrB菌株增強表達了一個分子量為147 kDa的組分。MALDI-TOF鑒定該組分為溶血素前體蛋白EthA,說明E. tarda溶血素的表達受到雙組分系統(tǒng)EsrA-EsrB的調(diào)控。隨后發(fā)現(xiàn)E. tarda AesrB菌株的溶血活性及溶血素表達呈現(xiàn)典型的溫度誘導(dǎo)性。基于全基因組測序信息及EMSA鑒定,本研究確證核酸結(jié)合蛋白Hha能通過直接結(jié)合到溶血素前體ethA啟動子上游,響應(yīng)胞外環(huán)境應(yīng)激調(diào)控基因表達。 最新鑒定的細菌跨界群體感應(yīng)系統(tǒng)能響應(yīng)宿主激素信號腎上腺素和去甲腎上腺素,并顯著影響細菌的感染致病力。作為具有廣泛宿主適應(yīng)性的兼性胞內(nèi)寄生菌,E. tarda進化出多種菌體表面結(jié)構(gòu)(鞭毛、纖毛和分泌系統(tǒng))以實現(xiàn)宿主感染。本研究鑒定了E.tarda中跨界群體感應(yīng)系統(tǒng)QseB-QseC系統(tǒng),通過同源重組將qseB和qseC進行的框內(nèi)缺失,發(fā)現(xiàn)E. tarda QseB-QseC系統(tǒng)調(diào)控了鞭毛介導(dǎo)的運動能力、纖毛介導(dǎo)的甘露糖抑制型血細胞凝集能力及Ⅲ型分泌系統(tǒng)介導(dǎo)的胞內(nèi)寄生能力。進一步分析發(fā)現(xiàn),腎上腺素信號能通過QseB-QseC系統(tǒng)影響鞭毛介導(dǎo)的運動性及TTSS元件介導(dǎo)的胞內(nèi)寄生能力。此外,本研究也首次利用分子進化模型對E. tarda中新型跨界群體感應(yīng)系統(tǒng)QseB-QseC進行了進化分析,發(fā)現(xiàn)受體元件QseC的進化顯然受到環(huán)境壓力選擇的影響,暗示了E. tarda廣泛宿主適應(yīng)能力是在宿主及環(huán)境壓力中選擇進化的結(jié)果。
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【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378;S941

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳曉鳳,周常義,青新;鱉“白板病”致病細菌的研究[J];水產(chǎn)學(xué)報;1997年03期

2 劉紅,董杰,劉墨青,金奇;一種從感染的培養(yǎng)細胞中分離細菌RNA的方法[J];微生物學(xué)報;2004年05期

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本文編號：2368068