發(fā)布時(shí)間：2018-12-07 16:52

【摘要】：目的 嚴(yán)重創(chuàng)傷后的大段韌帶組織缺損一直是修復(fù)重建外科的難題，目前臨床上多采用韌帶移植來(lái)修復(fù)、重建損傷的韌帶組織，目前臨床使用移植材料較多。其中自體韌帶移植臨床使用廣泛，但由于供體部位功能缺損，手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)，創(chuàng)傷大，及移植后韌帶的疤痕愈合等問(wèn)題使其常無(wú)法達(dá)到滿意的臨床效果。組織工程韌帶（tissue-engineered ligament，TEL）是目前組織工程研究的熱點(diǎn)，作為韌帶組織理想的替代物，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）利用支架和種子細(xì)胞在體外構(gòu)建，避免了再次取材給患者帶來(lái)的痛苦；（2）根據(jù)缺損情況進(jìn)行塑形、構(gòu)建，對(duì)于大段的韌帶缺損優(yōu)點(diǎn)突出；（3）有效降低了免疫反應(yīng)及力學(xué)強(qiáng)度下降問(wèn)題。 TEL由種子細(xì)胞和具有韌帶性能的支架復(fù)合而成，種子細(xì)胞的選擇是TEL構(gòu)成的關(guān)鍵步驟。而其中采用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向肌腱細(xì)胞分化的研究是TEL種子細(xì)胞研究的熱門方向。BMSCs可以通過(guò)骨髓穿刺獲得，體外易于分離、純化、培養(yǎng)、擴(kuò)增，短期內(nèi)即可獲得構(gòu)建TEL需要的細(xì)胞數(shù)量。動(dòng)物研究表明bFGF是韌帶愈合過(guò)程中重要的生長(zhǎng)因子，其可促進(jìn)韌帶的愈合并能誘導(dǎo)BMSCs向韌帶細(xì)胞方向分化。局部應(yīng)用重組細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，代謝較快，價(jià)格較高，且局部免疫反應(yīng)大，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)能有效克服上述缺點(diǎn)。本研究嘗試?yán)孟俨《据d體將bFGF及綠色熒光基因（enhanced green fluorescentprotein，，eGFP）轉(zhuǎn)入h-BMSCs，并評(píng)價(jià)bFGF的表達(dá)情況，及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖、分化及產(chǎn)生韌帶特異性細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)情況。 方法 1．?dāng)y帶人bFGF基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒載體Ad.bFGF-eGFP的構(gòu)建。（病毒構(gòu)建由invitrogen公司構(gòu)建）； 2．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，h-BMSCs）的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定； （1）骨髓采集及h-BMSCs的分離、純化：采用髂前上棘穿刺獲取10ml骨髓/人，采用梯度離心法和貼壁法結(jié)合分離、培養(yǎng)、純化h-BMSCs。 （2）h-BMSCs的鑒定：采用形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞儀鑒定單克隆抗體，及三向誘導(dǎo)分化相結(jié)合進(jìn)行h-BMSCs的鑒定。 3．利用Ad.bFGF-eGFP在體外轉(zhuǎn)染h-BMSCs，設(shè)正常h-BMSCs及轉(zhuǎn)染空病毒的h-BMSCs為對(duì)照組，觀察三組細(xì)胞的增殖情況及bFGF、韌帶特異性細(xì)胞外基因的表達(dá)和分泌的情況； （1）用Ad.bFGF-eGFP采用50的MOI值體外轉(zhuǎn)染h-BMSCs，通過(guò)綠色熒光測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。三組細(xì)胞采用ELISA方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中bFGF進(jìn)行定量分析。 （2）轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、多向誘導(dǎo)分化能力及產(chǎn)生韌帶特異性細(xì)胞外基質(zhì)的情況：細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中每日在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及增殖情況，采用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線。用RT-PCR方法定量檢測(cè)h-BMSCs中Ⅰ型膠原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原（Collagen Ⅲ）、纖維連接蛋白（Fibronectin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）在基因水平的表達(dá)。Western-blot半定量檢測(cè)bFGF對(duì)h-BMSCs中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Fibronectin、α-SMA、Vimentin蛋白水平表達(dá)的影響。 結(jié)果 1．原代培養(yǎng)的h-BMSCs貼壁后細(xì)胞開(kāi)始增殖，細(xì)胞由圓形轉(zhuǎn)化為三角形、多角形和梭形，1周后，單克隆細(xì)胞集落開(kāi)始出現(xiàn)，并呈指數(shù)增殖，10ml骨髓液分離得到的h-BMSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增3周可獲取2×107個(gè)細(xì)胞。 2．分離的h-BMSCs不表達(dá)CD29、CD90，表達(dá)CD34和/或CD45，在不同的的培養(yǎng)基下，細(xì)胞具有出現(xiàn)三向分化潛能：成骨、成脂、成軟骨方向誘導(dǎo)分化。 3．?dāng)y帶bFGF基因的腺病毒對(duì)細(xì)胞有很高的轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)MOI值為50時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高可達(dá)到95%以上。轉(zhuǎn)染后采用ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染組bFGF表達(dá)量較轉(zhuǎn)染Ad.eGFP組及未轉(zhuǎn)染組有顯著差異。分泌的峰值出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第2天，至第7d表達(dá)量仍有顯著性差異，此后表達(dá)逐漸下降，但仍保持在一個(gè)可檢測(cè)水平之上。 4．Ad.bFGF-eGFP轉(zhuǎn)染組h-BMSCs表現(xiàn)為均勻一致的纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞表型，呈梭形帶有長(zhǎng)的細(xì)胞突起，細(xì)胞密度明顯高于兩組對(duì)照組。Western-blot及RT-PCR方法檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、Fibronectin、α-SMA、Vimentin在蛋白水平及基因水平表達(dá)均顯著高于對(duì)照組。 結(jié)論 1．h-BMSCs方便獲取，穿刺過(guò)程對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷小。體外擴(kuò)增能力強(qiáng)大，10ml骨髓在體外培養(yǎng)三周后即可獲取2×107個(gè)細(xì)胞，可以滿足構(gòu)建TEL所需細(xì)胞數(shù)量，是構(gòu)建TEL比較理想的種子細(xì)胞。 2. Ad.bFGF-eGFP能夠在體外高效地轉(zhuǎn)染h-BMSCs，轉(zhuǎn)染后的h-BMSCs在短時(shí)間內(nèi)較多的表達(dá)bFGF蛋白。在bFGF的作用下，h-BMSCs增殖速度明顯加快，表形均一并向成纖維細(xì)胞表型分化，轉(zhuǎn)染后的h-BMSCs韌帶特異性細(xì)胞外基質(zhì)在基因水平及蛋白水平的表達(dá)均有顯著性增強(qiáng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 沙德峰,辛?xí)程?楊曉霞,吳錦生,魏侃,徐媛,安貴林;肌腱損傷縫接處置入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子復(fù)合緩釋降解膜的研究[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2004年02期

本文編號(hào)：2367493