【摘要】：云南和廣西位于我國西南邊陲,是我國HIV-1疫情最嚴重的地區(qū)。截止2010年底,兩地累計報告感染人數(shù)分列全國的第一和第二位。云南省是我國HIV-1流行的發(fā)源地,流行毒株的基因亞型很復(fù)雜,且處在動態(tài)改變的過程中,從最初出現(xiàn)的B(B’)亞型,到印度C亞型的傳入,再到CRF01_AE從泰國傳入,以及CRF07_BC和CRF08_BC的大量出現(xiàn)而B(B’)和C亞型卻在逐漸消失,這些亞型的起源、傳播、流行甚至消失所經(jīng)歷的一系列變化,至今仍知之甚少。廣西是目前我國艾滋病疫情上升最快的地區(qū),早期主要是在靜脈吸毒人群(IDUs)中流行,毒株亞型以CRF08_BC為主,但近年來HIV-1迅速從IDU人群向性傳播人群擴散,流行的亞型也出現(xiàn)CRF01_AE增多的趨勢,呈現(xiàn)B(B’)、C、CRF08_BC和CRF01_AE同時流行的態(tài)勢。云南和廣西東西相鄰,同為少數(shù)民族聚集區(qū),與之接壤的東南亞國家(泰國、緬甸、越南等)都是HIV-1高度流行的地區(qū),相似的地理位置和社會人口狀況,使得兩地的HIV-1流行有著緊密的聯(lián)系。在云南和廣西進行HIV毒株的遺傳多樣性和進化研究,全面、系統(tǒng)地揭示毒株的基因變異和分子進化特征、闡明兩地流行毒株之間的關(guān)系,對于云南和廣西乃至全國艾滋病流行形勢的分析、抗HIV藥物和疫苗研發(fā)等都具有重要意義。 本文收集了近2年內(nèi)確認的分布于云南15個地市的788例和分布于廣西13個地市的294例HIV-1感染者的血液標(biāo)本,通過對毒株gag、pol全長和env C2V3基因的擴增和測序以及部分毒株的全長基因擴增測序,利用MEGA 5.03、BEAST v 1.5.4等多種軟件工具和在線分析工具,分析了云南和廣西HIV-1流行毒株的變異特點及兩地毒株之間的傳播和進化關(guān)系。 一、建立HIV-1 gag、pol全長和env C2V3基因的擴增和測序方法,并對采集的標(biāo)本進行擴增測序: 1、設(shè)計擴增和測序引物,優(yōu)化反應(yīng)條件,從血標(biāo)本中提取病毒RNA,采用RT-PCR方法擴增全長gag(1584bp)和pol(3147bp)基因和部分env C2V3基因(558bp)。將gag和pol基因區(qū)的序列連在一起,作為一個完整的基因區(qū)(gag-pol)(HXB2:790-5096)進行分型分析。 2、對標(biāo)本進行擴增和測序:在云南的788份標(biāo)本中,gag基因區(qū)擴增成功700例、pol基因區(qū)擴增成功666例、env C2V3基因區(qū)擴增成功692例;在廣西294份血漿標(biāo)本中,gag基因區(qū)擴增成功285例、pol基因區(qū)擴增成功274例、env C2V3基因區(qū)擴增成功283例。病毒載量對擴增成功率有顯著影響。 二、云南省HIV-1毒株的基因變異和進化特征 1、云南省HIV-1毒株的基因亞型及分布:(1)云南省流行的HIV-1毒株種類多樣,按照構(gòu)成比大小依次為CRF08_BC、CRF01_AE、CRF07_BC、未知重組型及C亞型和B(B’)亞型。(2)云南各地HIV-1毒株的分布不同,大致可分為4種:a)以臨滄為代表,包括鄰近的保山和大理:以CRF08_BC為主,占到70%以上,而CRF01_AE僅為1/6或更少;b)德宏地區(qū):CRF08_BC與CRF01_AE的構(gòu)成比類似,各約占1/4,未知重組型則占到1/3;c)西雙版納和普洱地區(qū):CRF01_AE稍多于CRF08_BC,二者占到了80%以上;d)昆明和紅河地區(qū):CRF08_BC比CRF01_AE的比例大,CRF07_BC所占的比例(分別為18.0%和19.5%)較高,且均有部分未知重組型。(3)未知重組型在少數(shù)民族中的所占的比例(17.0%)顯著高于在漢族中的比例(6.7%)(P0.01)。(4)在兩種主要傳播途徑—異性性接觸和IDUs中,亞型分布具有顯著差異(P0.01)。在異性性接觸途徑中,CRF08_BC和CRF01_AE占主導(dǎo),分別為52.7%和29.1%,而在IDUs中,CRF08_BC亦占到一半,未知重組型和CRF07_BC的比例一樣,均為15.5%,但CRF01_AE僅為5.4%。 2、CRF08_BC毒株的系統(tǒng)進化特征:(1)異性性接觸人群及IUDs人群均未發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)序列完全聚集的現(xiàn)象,表明CRF08_BC流行毒株在云南的傳播幾乎沒有地區(qū)局限性;(2)在異性性傳播人群中,CRF08_BC在臨滄地區(qū)分布較散,與其它地區(qū)人群的毒株交叉較多,但有一個相對分開的包括其他5個地區(qū)的進化簇,以西雙版納的毒株最多,提示西雙版納的異性性傳播人群中可能存在相對臨滄獨立的人群。(3)在IDUs中,6條紅河-IDUs和2條昆明-IDUs序列與廣西、云南文山以及遼寧的參考序列聚集成簇,而廣西的參考序列(97CNGX6F、97CNGX7F、97CNGX9F)是我國最早發(fā)現(xiàn)的CRF08_BC毒株,表明紅河和昆明的IDUs人群可能是云南最早與廣西有傳播關(guān)系的人群。云南其它地區(qū)的IDUs則完全散在分布在異性性接觸人群中,系統(tǒng)進化樹中沒有超過3條序列聚集的情況,表明CRF08_BC在云南IDUs人群中的傳播沒有明顯的區(qū)域和人群聚集性。 3、CRF01_AE毒株的系統(tǒng)進化特征:云南的HIV-1 CRF01_AE流行毒株在系統(tǒng)進化樹中有三個明顯的進化簇:簇1為9條臨滄-異性性傳播人群序列,與7條泰國歷史參考株聚集;進化簇2為11條西雙版納-異性性傳播人群的序列,與10條越南歷史參考株和3條廣西現(xiàn)代參考株聚集;簇3為9條西雙版納-異性性傳播人群序列,與3條福建現(xiàn)代參考株聚集。其它地區(qū)的序列則交叉分散。從各地的流行時間推斷,臨滄地區(qū)的CRF01_AE可能來自泰國,西雙版納地區(qū)的則可能來自越南,而廣西、福建等地CRF01_AE可能與西雙版納有傳播關(guān)系。 4、CRF07_BC毒株的系統(tǒng)進化特征:42條CRF07_BC gag-pol序列與參考株形成一個大簇,新疆2005年的參考株位于簇中,1997年的參考株株靠近簇的外側(cè)。各地的流行毒株彼此交錯,無明顯聚集,異性性接觸人群和IDUs也沒有聚集成簇,表明CRF07_BC在云南的流行傳播無明顯地區(qū)和人群聚集性。 5、未知重組型的鑒定和分布:(1)共發(fā)現(xiàn)63株未知重組毒株,占10.2%。重組模式包括3種:B(B’)/C(47例)、CRF_01AE/B(B’)/C(12例)和CRF_01AE/C(4例)。鑒定出3組具有的相似重組斷點的序列,繪制出各組的重組鑲嵌模式圖。(2)未知重組毒株的分布:傳播途徑方面以異性性接觸(30例)和IDUs(19例)為主。在IDUs中占的比例為15.5%,顯著大于異性性傳播人群(7.75%)(P0.01)。在重組模式方面,在IDUs中幾乎全是B/C重組(18/19),而在異性性傳播人群中CRF_01AE/B(B’)/C和CRF_01AE/C模式占到了40%(11/28);在地區(qū)分布方面,德宏地區(qū)的未知重組型最多,占總數(shù)的一半,且大部分集中在IDUs人群中;昆明及鄰近的紅河未知重組型主要分布在異性性傳播人群;在感染人數(shù)最多的臨滄地區(qū)未知重組型卻非常少。 6、gag-pol序列和env C2V3序列的基因離散率和選擇壓力:(1)gag-pol序列的基因離散率,B(B’)亞型最大(6.15±2.00)%,然后從大到小依次為C亞型(3.09±0.94)%,CRF01_AE(2.19±0.36)%,CRF07_BC(2.77±0.48)%,CRF08_BC最小(1.17±0.31)%。各亞型中g(shù)ag序列的基因離散率均大于pol序列。在gag基因的編碼區(qū)段中,各個亞型有相同的規(guī)律,即P17與P2P6區(qū)段的基因離散率較大,P24區(qū)段較小;在pol基因的編碼區(qū)段中,各個亞型的大小規(guī)律有一定的差異。各亞型env C2V3序列的基因離散率均比gag-pol序列大。(2)gag-pol序列所有編碼區(qū)段的globleω(dN/dS)均1,受到負向選擇壓力,各亞型中P17區(qū)段的globleω值最大(0.50±0.05),P2P6區(qū)段次之(0.36±0.03),其余區(qū)段的globleω值均較小。env C2V3序列的globleω值在各亞型中均接近1。無論gag-pol序列env C2V3序列,各亞型之間受到的選擇壓力均相似。 7、env C2V3序列的V3環(huán)頂端四肽和輔助受體預(yù)測:(1)B(B’)亞型流行毒株的V3環(huán)頂端四肽主要以GPGR為主,所占比例為94.7%,而C亞型(CRF07/08_BC)和CRF01_AE則以GPGQ為主,所占比例分別為97.8%和76.5%,CRF01_AE的頂端四肽模式多達6種,相對其它亞型更為復(fù)雜。(2)B(B’)亞型流行毒株中可能使用CCR5輔助受體和CXCR4輔助受體的毒株幾乎各占一半,而C亞型(CRF07/08_BC)和CRF01_AE流行毒株則都可能以使用CCR5輔助受體為主,所占比例分別高達98.3%和88.6%。 三、廣西HIV-1流行毒株的基因變異和分子進化特征 1、廣西HIV-1毒株的基因亞型及分布:(1)廣西流行的HIV-1毒株種類多樣,按照構(gòu)成比大小依次為CRF01_AE、CRF08_BC、CRF07_BC、未知重組型、B(B’)亞型、G亞型。(2)毒株的傳播途徑分布,CRF01_AE在三種主要傳播途徑中均占優(yōu)勢,在異性性傳播占79.5%、在IUDs占58.8%、在同性性傳播占71.4%。在異性性傳播人群中還有大量CRF07_BC、CRF08_BC、B(B')和未知重組型。三種感染途徑的亞型構(gòu)成有顯著性差異(P0.01)。(3)異性性傳播是廣西最主要的HIV傳播途徑,在這個人群中CRF01_AE毒株的比例在10個地區(qū)都超過80%,在4個地區(qū)為100%,僅在南寧、欽州和百色為50-60%。異性性傳播人群中CRF07_BC和CRF08_BC僅占6.3%和10.6%,其中CRF07_BC絕大部分在南寧,CRF08_BC則主要分布在南寧和崇左。 2、CRF01_AE毒株的系統(tǒng)進化特征:在系統(tǒng)進化樹上,按照N3,Bootstrap值70%的原則,發(fā)現(xiàn)CRF01_AE毒株形成2個較大的進化簇(簇1、簇2)和2個較小的進化簇(簇3、簇4)。簇1中沒有國外的參考序列,簇中廣西和福建參考序列都是年代較近的序列,而簇2中的參考序列大部分為越南早期的序列,而3條廣西參考株包括了1997年最早在廣西發(fā)現(xiàn)的參考株(97CNGX2F),由此推斷,簇1中的流行毒株可能源自國內(nèi),而簇2中的流行毒株可能源自越南。 3、CRF07_BC、CRF08_BC和B(B’)亞型的系統(tǒng)進化特征:CRF08_BC毒株以來自南寧地區(qū)為最多,通過系統(tǒng)進化樹分析,發(fā)現(xiàn)其它地區(qū)的毒株序列均與南寧的毒株序列聚集在一起;CRF07_BC的進化簇也以南寧的序列占優(yōu)勢,其它地區(qū)的序列與之聚集,其中有一個由8條來自南寧異性性傳播人群的序列聚集在一起的進化簇,表明南寧可能存在CRF07_BC毒株的局部流行。4條B亞型序列中,河池的2條序列與泰國B亞型參考序列聚集,而且這兩條序列形成了一個Bootstrap值為99%的進化枝,表明二者很大可能為傳播關(guān)系。 4、未知重組毒株的分析:共發(fā)現(xiàn)7株未知重組型毒株,占2.6%。7株中有6株以CRF01_AE為母株與B和(或)C亞型毒株重組,其中01_AE/B重組3條,01_AE/C重組1條,01_AE/B/C重組2條,與CRF01_AE是當(dāng)前廣西地區(qū)流行的主要毒株有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)了1例在gag-po l區(qū)由CRF_07BC和CRF_08BC毒株重組形成的的二代重組毒株,基因序列分析顯示該毒株是以CRF07_BC為骨架,在pol區(qū)有兩段794bp和782bp的CRF08_BC片段插入。 5、gag-pol序列和env C2V3序列的基因離散率和選擇壓力特征:(1)gag-pol序列的基因離散率,B(B’)亞型最大(4.41±2.18)%,然后為CRF08_BC(2.72±0.52)%,CRF07_BC(2.37±1.04)%,CRF01_AE最小為(2.09±1.16)%。除B(B’)亞型外,其它亞型中g(shù)ag序列的基因離散率均大于pol序列。在gag基因的編碼區(qū)段中,P17與P2P6區(qū)段的基因離散率較大,P24區(qū)段較小,在pol基因的編碼區(qū)段中,各個亞型的大小規(guī)律有一定的差異。各亞型env C2V3序列的基因離散率均比gag-pol序列大。(2)gag-pol序列所有編碼區(qū)段的globleω(ω= dN/dS)均1,受到負向選擇壓力,各亞型中P17區(qū)段的globleω值最大,P2P6區(qū)段次之,其余區(qū)段均較小。各亞型之間受到的選擇壓力均相似。 6、env C2V3序列的V3環(huán)頂端四肽和輔助受體預(yù)測:(1)B(B’)亞型流行毒株的V3環(huán)頂端四肽主要以GPGR為主,所占比例為83.3%,而C亞型(CRF07/08_BC)和CRF01_AE則以GPGQ為主,所占比例分別為100.0%和71.2%,CRF01_AE的頂端四肽模式多達7種,相對其它亞型更為復(fù)雜。(2)C亞型(CRF07/08_BC)和CRF01_AE流行毒株均以可能使用CCR5輔助受體為主,所占比例分別高達100.0%和91.5%。 四、廣西HIV-1主要流行毒株與云南毒株的傳播關(guān)系及其起源時間 云南和廣西HIV-1流行毒株的基因亞型均以CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC為主,但三種毒株在兩地構(gòu)成比卻大相徑庭。云南以CRF08_BC為主,CRF01_AE次之,CRF07_BC較少,與之前的報道基本一致,表明云南的HIV-1流行亞型基本趨于穩(wěn)定;而廣西以CRF01_AE占絕大部分,CRF07_BC和CRF08_BC則較少,亞型分布與之前的報道有較大差異,推測廣西HIV-1流行亞型可能正在發(fā)生改變。本部分研究,通過系統(tǒng)進化的方法分析廣西HIV-1主要流行毒株與云南流行毒株之間的關(guān)系,并運用Bayesian合并理論方法推斷廣西主要流行亞型的起源時間。 1、廣西與云南CRF01_AE流行毒株的關(guān)系及傳入時間:第二部分研究中,在廣西CRF01_AE流行毒株gag-pol序列系統(tǒng)進化樹中,我們發(fā)現(xiàn)了2個較大的進化簇(簇A和簇B)。將這兩簇序列與云南CRF01_AE 110條序列以及51條參考序列一起,分別繪制系統(tǒng)進化樹,發(fā)現(xiàn)廣西的CRF01_AE流行毒株其中的一簇很可能來自越南,與云南部分CRF01_AE流行毒株有一定的傳播關(guān)系,另一簇來源不明,與云南毒株存在傳播關(guān)系的可能性較小。 廣西CRF01_AE毒株簇A的gag-pol區(qū)段的進化速率為2.68×10~(-3)(95%HPD 2.15-3.12×10~(-3))替換/位點/年。推算CRF01_AE傳入泰國的時間為1982.4年(95%HPD 1980.1-1986.3),傳入越南北部和廣西的時間為1996.3年(95%HPD 1994.7-1997.0)。廣西CRF01_AE的簇A可能由福建傳入,并可能存在多個時間點的傳播事件,而且該簇毒株進入我國的時間要早于CRF01_AE流行毒株從越南北部傳入我國廣西。簇B流行毒株gag-pol區(qū)段的進化速率為2.56×10~(-3)(95%HPD 2.26-2.88×10~(-3))替換/位點/年,推測簇B毒株傳入越南北部和廣西的時間為1993.1年(95%HPD 1991.4-1995.1)。CRF01_AE簇B株在1993年左右從越南北部傳到與之接壤的我國廣西崇左,以及鄰近的北海、防城港和欽州地區(qū),逐漸向中部的南寧擴散,在1996年左右傳入河池地區(qū)。 2、廣西與云南CRF07_BC流行毒株的關(guān)系:從進化樹上可以看到,廣西CRF07_BC流行毒株形成了3個可靠的進化簇(Bootstrap值均為99%),僅簇1同時有云南和廣西的序列,但云南的毒株為偶發(fā)的職業(yè)暴露感染,簇2和簇3都為廣西內(nèi)部的序列聚集成簇,提示當(dāng)前廣西的CRF07_BC流行毒株與云南的流行毒株存在直接傳播關(guān)系的可能性較小。 CRF07_BC流行毒株gag-pol區(qū)段的進化速率為1.84×10~(-3)(95%HPD 1.49-2.19×10~(-3))替換/位點/年。CRF07_BC流行毒株進入廣西的時間為1991.4年(95%HPD 1990.0-1994.6)。廣西的CRF07_BC流行毒株形成了3個較可靠(后驗概率0.7)的次級進化簇(簇1、簇2、簇3)。推測簇1中的毒株源于云南。簇2祖先株形成時間(tMRCA)為6.2年(95%HPD 4.7-7.0)、簇3祖先株形成時間tMRCA為5.8年(95%HPD 3.8-6.5)。推測廣西CRF07_BC流行毒株的起源時間在1991年左右,來源相對復(fù)雜,最早的來源可能為云南,而在南寧流行的部分毒株可能為2004年左右傳入,來源尚不能確定。 3、廣西與云南CRF08_BC流行毒株的傳播關(guān)系:大部分廣西CRF08_BC序列均與廣西1997年的參考序列聚集在一起,僅有少數(shù)序列與云南的序列聚集。推測云南的CRF08_BC通過IDUs傳入廣西百色,由于奠基者效應(yīng),形成了與云南不完全相同的相對獨立的流行。 我國CRF08_BC流行毒株gag-pol區(qū)段的進化速率為2.44×10~(-3) (95%HPD 2.10-2.78×10~(-3))替換/位點/年,起源時間為1993.0年(95%HPD 1990.3-1994.6)。廣西CRF08_BC流行毒株有22條與廣西1997年的參考株聚集成簇(后驗概率0.7),最近祖先形成時間(tMRCA )即為CRF08_BC傳入廣西的時間,為1997.3年(95%HPD 1996.1-1997.4)。該簇毒株與2000年云南文山和紅河的參考株形成可靠的進化簇,可以推測,廣西CRF08_BC流行毒株由云南的文山、紅河等地傳入。另外,廣西CRF08_BC流行毒株大部分只與最早進入廣西的參考株聚集,而與云南的CRF08_BC流行毒株分開,再次提示CRF08_BC進入廣西后,由于奠基者效應(yīng),形成了相對于云南獨立的流行。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R373

【參考文獻】

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本文編號：2361059