【摘要】：基礎(chǔ)和流行病學(xué)研究證實(shí),糖代謝異常[包括糖尿病、空腹血糖受損(impaired fasting glucose, IFG)和糖耐量減低(impaired glucose tolerance, IGT)]與缺血缺氧性腦損傷之間存在著密切的內(nèi)在聯(lián)系。葡萄糖作為腦組織最重要的能量來(lái)源,其水平過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響神經(jīng)功能、造成不同程度的腦損傷。低血糖與高血糖均是腦梗死的重要危險(xiǎn)因素,兩者在腦梗死防治中具有同等的重要性�？刂蒲撬讲▌�(dòng)對(duì)減輕腦缺血再灌注引起的損傷具有一定的意義。 急性腦缺血可誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化現(xiàn)象,促進(jìn)自我修復(fù),但其增殖數(shù)量上的不足致使自我修復(fù)功能受限。已有研究表明,血糖水平是限制缺氧后神經(jīng)干細(xì)胞存活和自我更新能力的關(guān)鍵因素。血糖水平波動(dòng)是否影響缺血缺氧環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞的存活和增殖能力,進(jìn)而限制了其對(duì)神經(jīng)損傷的自我修復(fù)功能?目前,相關(guān)研究還不多見。既往研究大都集中在持續(xù)性高濃度葡萄糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的存活、增殖及凋亡的影響研究,并認(rèn)為一定濃度的高糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧損傷具有保護(hù)作用。但是在實(shí)際臨床實(shí)踐中,急性腦卒中患者病程的進(jìn)展過(guò)程極不穩(wěn)定,患者體內(nèi)血糖容易出現(xiàn)頻繁的波動(dòng)改變,數(shù)值差距變化浮動(dòng)大,所以以往的研究模式不能完全客觀真實(shí)地反映糖尿病患者體內(nèi)由于血糖的不斷變化而對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生的損傷效應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)用成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞在體外建立缺血缺氧損傷模型,并模擬腦梗死患者缺血后出現(xiàn)的血糖波動(dòng)現(xiàn)象,采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot等技術(shù)方法觀察波動(dòng)性與持續(xù)性高濃度葡萄糖對(duì)缺血缺氧條件下培養(yǎng)后的神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖能力和MAPK信號(hào)通路的的影響,從而從另外一個(gè)角度探索波動(dòng)性高血糖加重缺血性腦損傷的病理機(jī)制,進(jìn)而為臨床上腦缺血患者急性期血糖控制提供一定的參考。 第一部分成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外缺血缺氧損傷模型的建立 目的：探討一種簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可重復(fù)的大鼠成年神經(jīng)干細(xì)胞體外缺血缺氧損傷模型制備方法。 方法： 1、細(xì)胞來(lái)源：采用來(lái)自于成年Fisher344大鼠的海馬神經(jīng)干細(xì)胞系(ANSCs)為研究對(duì)象,無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)并傳代,用巢蛋白(Nestin)和DAPI免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)其神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性。 2、建立體外神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧損傷模型的方法：三氣培養(yǎng)箱物理缺氧、無(wú)糖Earle's平衡鹽溶液缺糖相結(jié)合的方法,即將三氣培養(yǎng)箱氧氣濃度調(diào)至1%,制備缺氧環(huán)境,將培養(yǎng)基換為不含葡萄糖的Earle's培養(yǎng)基,分別缺氧2h,4h,6h,8h,10h后取出細(xì)胞,更換為正常神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基,恢復(fù)正常條件繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置常氧常糖正常對(duì)照。 3、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、活力及凋亡改變檢測(cè)：缺氧缺糖2-10h不等時(shí)間后,恢復(fù)正常條件繼續(xù)復(fù)氧培養(yǎng)24h,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活力以及細(xì)胞凋亡率改變：倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化；CCK-8比色法測(cè)定細(xì)胞活力變化；Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。比較不同缺氧時(shí)間對(duì)細(xì)胞的損傷程度,確定適合神經(jīng)干細(xì)胞的合適缺氧缺糖時(shí)間。 結(jié)果： 1、培養(yǎng)體系中的細(xì)胞94%以上呈Nestin強(qiáng)陽(yáng)著色,說(shuō)明其94%以上細(xì)胞均處于原始未分化狀態(tài),并具有增殖能力,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 2、缺糖缺氧2h時(shí),神經(jīng)干細(xì)胞活力未見下降反而存活率有一定的增加。但隨著缺氧缺糖時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞存活率逐漸下降,凋亡率逐漸增高,且缺氧缺糖6h起細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性開始受到破壞,細(xì)胞存活率較正常對(duì)照組顯著下降,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1、采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧、無(wú)糖Earle's平衡鹽溶液缺糖相結(jié)合的方法可成功建立一種簡(jiǎn)便、有效的神經(jīng)干細(xì)胞體外缺血缺氧損傷模型。 2、缺氧缺糖6小時(shí)可能是成年神經(jīng)干細(xì)胞體外氧糖／剝奪模型的合適時(shí)間,該模型可用于神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧損傷的體外實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究。第二部分波動(dòng)性高糖對(duì)成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧損傷的影響 目的： 觀察波動(dòng)性與持續(xù)性高濃度葡萄糖對(duì)缺血缺氧條件下培養(yǎng)后的神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖能力的影響。 方法： 1、建立神經(jīng)干細(xì)胞體外缺血缺氧損傷模型：采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧、無(wú)糖Earle's平衡鹽溶液缺糖相結(jié)合的方法造成神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧損傷。 2、實(shí)驗(yàn)分組：缺氧后以17.5mmol/1(對(duì)照組)、27.75mmo1/1(持續(xù)高糖H1組)、41.75mmol/1(持續(xù)高糖H2組)及17.5/41.75mmol/1(波動(dòng)性高糖組,白天三小時(shí)高糖兩小時(shí)正常濃度葡萄糖波動(dòng)三次,高糖過(guò)夜)四種不同濃度的葡萄糖進(jìn)行復(fù)氧培養(yǎng)。為排除滲透壓對(duì)細(xì)胞活性的影響,用甘露醇作為滲透壓對(duì)照,用CCK-8法對(duì)其處理后24h的ANSCs細(xì)胞活性進(jìn)行了檢測(cè)。 3、神經(jīng)干細(xì)胞活力及增殖檢測(cè)：在復(fù)氧培養(yǎng)后12h、24h、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)成年神經(jīng)干細(xì)胞的活力、增殖情況進(jìn)行了比較：倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化；CCK-8比色法測(cè)定細(xì)胞活力變化；EdU標(biāo)記法測(cè)定細(xì)胞增殖變化；PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果： 1、CCK-8比色法計(jì)量神經(jīng)干細(xì)胞活力顯示：各組在48h內(nèi)吸光度值逐漸增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。其中,12h時(shí)持續(xù)高糖H1組吸光度值顯著高于其他各組。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),各組細(xì)胞吸光度值較對(duì)照組均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。在各個(gè)時(shí)間段內(nèi),波動(dòng)性高糖組細(xì)胞光密度值均顯著低于其他三組(P0.01)。 2、而滲透壓對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示,甘露醇對(duì)照組與葡萄糖對(duì)照組間的細(xì)胞活性均無(wú)顯著性差異(P0.05),這提示持續(xù)高糖組與波動(dòng)性高糖組的細(xì)胞活性下降并非滲透壓所致。 3、EdU標(biāo)記法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行增殖分析：持續(xù)高糖H1組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率為37.28±6.56%,與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性意義(P0.05)。而持續(xù)高糖H2組、波動(dòng)性高糖組EdU陽(yáng)性細(xì)胞率分別下降至26.86±5.19%、20.33±5.25%,兩者與對(duì)照組比較,差異均具有顯著性意義(P0.01)。 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)提示：在持續(xù)高糖和波動(dòng)性高糖環(huán)境下培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞,其G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多,S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少；反映增殖活性的兩個(gè)參數(shù)PI和SPF,均較對(duì)照組顯著下降。結(jié)論： 1、缺血缺氧后及時(shí)恢復(fù)供應(yīng)葡萄糖,對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的缺血缺氧損傷可能有一定的保護(hù)作用。 2、缺血缺氧早期,輕度升高的葡萄糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的具有一定保護(hù)作用。缺血缺氧后期,持續(xù)性高糖和波動(dòng)性高糖則降低了成年神經(jīng)干細(xì)胞代謝和增殖活性,加重了缺血缺氧性損傷。 3、波動(dòng)性高糖比持續(xù)性高糖更顯著地抑制了神經(jīng)干細(xì)胞的活性。 4、持續(xù)高糖和波動(dòng)性高糖通過(guò)阻滯神經(jīng)干細(xì)胞于Gl/S轉(zhuǎn)變期,而抑制了細(xì)胞增殖。 第三部分波動(dòng)性高糖對(duì)缺氧后成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響 目的： 初步探討葡萄糖波動(dòng)對(duì)缺氧后成年大鼠神經(jīng)干細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的激活情況。 方法： 1、神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧損傷模型的制備：采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧、無(wú)糖Earle's平衡鹽溶液缺糖相結(jié)合的方法造成神經(jīng)干細(xì)胞缺血缺氧損傷。 2、細(xì)胞分組及處理：缺氧缺糖6h后,更換為含有不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),在24h后Western blot法檢測(cè)MAPK信號(hào)通路ERK、JNK及P38蛋白激活情況,每一時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。 結(jié)果： 1、缺血缺氧后各組神經(jīng)干細(xì)胞均表達(dá)ERK1/2、JNK和p38蛋白,各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2、各組神經(jīng)干細(xì)胞PERK1/2表達(dá)較正常組下降,且隨著濃度的升高其表達(dá)量進(jìn)一步下降,且波動(dòng)性高糖下復(fù)氧培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞PERK1/2表達(dá)量較其他各組均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PERK1/2的變化趨勢(shì)與細(xì)胞增殖變化一致。 3、在持續(xù)性高糖和波動(dòng)性高糖環(huán)境培養(yǎng)下的神經(jīng)干細(xì)胞JNK和p38MAPK蛋白的磷酸化水平均相應(yīng)顯著增加。 結(jié)論： 持續(xù)性高糖和波動(dòng)性高糖環(huán)境培養(yǎng)下的神經(jīng)干細(xì)胞,活性及增殖能力顯著下降,可能與JNK/P38MAPK通路的持續(xù)激活和ERK通路的同步抑制有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2358002