【摘要】：實驗?zāi)康模喝梭w內(nèi)紅細(xì)胞生成(erythropoiesis)是一個受體內(nèi)02的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生紅細(xì)胞的復(fù)雜過程。在成年人的體內(nèi),紅細(xì)胞是在骨髓中生成的,但是在早期的胚胎中,紅細(xì)胞是在卵黃囊的中胚層細(xì)胞中生成的。隨著老齡化社會的到來,對于血液的需求量不斷的增大,血源變的緊張。另外,病原微生物和疾病的傳播等問題也給血液臨床應(yīng)用的安全性和廣泛性帶來了很大的挑戰(zhàn)。因此,人們期望找到更為安全、經(jīng)濟(jì)和有效的血細(xì)胞和造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)的資源。雖然有研究者也對其它可大量生成紅細(xì)胞的HSCs進(jìn)行了研究,如臍帶血、骨髓以及外周血,但由于受到研究材料的限制,紅細(xì)胞的早期分化機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)向造血干／祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cells, HSCs/HPCs)分化以及向紅細(xì)胞方向的分化己有報道,但是這些研究大多利用了飼養(yǎng)層共培養(yǎng)體系或動物源血清,從而引入了可能影響分化的外源性調(diào)節(jié)因子。本研究擬通過利用人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)和hESCs可以體外擴(kuò)增從而不斷提供細(xì)胞材料這一特性,建立無飼養(yǎng)層細(xì)胞、無血清的定向誘導(dǎo)造血分化體系,進(jìn)而深入地研究人多潛能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)來源的HSCs/HPCs在化學(xué)成分明確的培養(yǎng)條件下定向誘導(dǎo)紅細(xì)胞分化以及TGF-β信號通路在這一分化過程中的調(diào)節(jié)作用,為將來解決臨床病人紅細(xì)胞血源問題探索技術(shù)途徑。實驗方法：為了明確不同生長因子對hPSCs定向誘導(dǎo)造血分化的影響,我們需要建立hPSCs無飼養(yǎng)層、無血清的造血誘導(dǎo)分化體系來進(jìn)行開展研究。無飼養(yǎng)層細(xì)胞的誘導(dǎo)分化體系能夠排除由于飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌的未知細(xì)胞因子對造血分化的影響,同時還可以排除飼養(yǎng)層細(xì)胞與待誘導(dǎo)分化細(xì)胞之間的相互作用以及細(xì)胞外基質(zhì)與分化細(xì)胞之間相互作用對造血分化的影響；無血清分化體系則排除了未知外源生長因子的影響,從而克服了傳統(tǒng)的共培養(yǎng)體系不能精確的反映不同生長因子對造血分化影響的困難。首先,hESCs和hiPSCs采用常規(guī)的hESCs培養(yǎng)方法培養(yǎng),即hPSCs培養(yǎng)在絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)層細(xì)胞上,每天更換新鮮hESC培養(yǎng)基。然后,將培養(yǎng)的多潛能干細(xì)胞克隆消化并制備成單細(xì)胞懸液,采用懸滴法形成擬胚體(Embryoid Body, EB),2天后收集形成的EBs并繼續(xù)進(jìn)行懸浮培養(yǎng),誘導(dǎo)造血分化。經(jīng)過8天左右的造血誘導(dǎo)分化后,EBs消化成單細(xì)胞并標(biāo)記上特異性抗CD34單克隆抗體進(jìn)行流式細(xì)胞分析,利用磁珠分選(MACS)的方法將HSCs/HPCs分選出來,經(jīng)流式細(xì)胞檢測進(jìn)一步鑒定CD34+ HSCs/HPCs的純度。最后,將分選獲得的高純度CD34+干祖細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。在造血分化的過程中進(jìn)行流式細(xì)胞檢測、CFC (colony-forming cell assay)、Wright-Geimsa染色、激光共聚焦顯微鏡檢驗鑒定造血分化各階段的細(xì)胞分化狀態(tài)；利用RT-PCR、實時定量PCR檢測各分化階段的血紅蛋白的表達(dá)情況；分光光度計檢測分析細(xì)胞內(nèi)G6PD酶活性。此外,為研究TGF-β信號通路在誘導(dǎo)紅細(xì)胞分化過程中的調(diào)節(jié)作用機(jī)制以及細(xì)胞外基質(zhì)與分化細(xì)胞的相互作用,我們分別利用BrdU和TNEL方法檢測了造血祖細(xì)胞在TGF-β以及其抑制劑調(diào)節(jié)作用下的細(xì)胞增殖周期和細(xì)胞凋亡。實驗結(jié)果：我們克服了hPSCs的單細(xì)胞懸液無法形成EB的困難,使得EB的形成效率達(dá)到90%以上。形成的EBs經(jīng)不同組合細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)分化為HSCs/HPCs,流式細(xì)胞分析檢測表明CD34+ HSCs/HPCs所占比例平均為15%。分化的CD34+HSCs/HPCs經(jīng)磁珠分選的方法分選純化后在無飼養(yǎng)層細(xì)胞、無血清條件下定向誘導(dǎo)紅細(xì)胞分化。hPSCs來源的CD34+HSCs/HPCs在細(xì)胞外基質(zhì)包被的培養(yǎng)板中首先貼壁存活生長,培養(yǎng)2天后可觀察到半貼壁細(xì)胞的出現(xiàn),隨著半貼壁細(xì)胞的增多而逐漸形成一些半貼壁細(xì)胞集落。培養(yǎng)6天后培養(yǎng)孔中可觀察到較多的懸浮細(xì)胞,流式細(xì)胞分析檢測表明,80±5%以上的細(xì)胞為CD71 high細(xì)胞,并且隨著體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞核逐漸固縮變小,細(xì)胞也逐漸變小,血紅蛋白表達(dá)水平逐漸提高,Wright-Giemsa染色表明細(xì)胞為紅系細(xì)胞；誘導(dǎo)培養(yǎng)10-15天的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光標(biāo)記后在共聚焦顯微鏡鏡下可觀察到無核的CD235a+/CD71+細(xì)胞的存在。同時我們檢測了不同造血生長因子對CD34+造血祖細(xì)胞譜系分化的影響,并發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素(erythroipoitin, EPO)信號通路對紅細(xì)胞的分化起主導(dǎo)作用；EPO除了可以顯著提高CD71+/CD235a+細(xì)胞數(shù)目,而且還提高了血紅蛋白的表達(dá)。而TGF-β (transforming growth factor β)在EPO和其它造血生長因子存在的條件下顯著性的減少了懸浮細(xì)胞的數(shù)目以及BFU-E的數(shù)目,然而CD71+細(xì)胞的百分率并沒有變化。我們的研究表明EPO信號通路和抑制TGF-β信號通路可協(xié)同促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的增殖。TGF-β對早期的干祖細(xì)胞的增殖有抑制效應(yīng),而對晚期較成熟的紅系細(xì)胞增殖沒有影響。然而,早期干祖細(xì)胞所處分化階段的不同,TGF-β所發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)也不一樣；對于早期的造血祖細(xì)胞,TGF-β通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制了祖細(xì)胞增殖；而對于紅系祖細(xì)胞TGF-β有促進(jìn)其分化發(fā)育為成熟細(xì)胞的作用,從而間接抑制了紅系祖細(xì)胞的分裂增殖,現(xiàn)象上表現(xiàn)為TGF-β抑制紅系祖細(xì)胞數(shù)目的增多。結(jié)論：本課題建立了無飼養(yǎng)層、無血清的hPSCs來源紅系祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系。我們的研究表明,在這一分化體系里EPO信號通路和抑制TGF-β信號通路可協(xié)同促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的增殖。TGF-β對早期的干祖細(xì)胞的增殖有抑制效應(yīng),但其促進(jìn)紅系祖細(xì)胞發(fā)育成熟。這為TGF-β在將來生產(chǎn)臨床應(yīng)用紅細(xì)胞時發(fā)揮調(diào)節(jié)作用提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329.2

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7 張e，

本文編號：2357577