【摘要】：Cell-in-cell是指一個或多個活的細胞進到另一個細胞的胞漿內(nèi)，形成細胞套疊結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，可以發(fā)生在同質(zhì)細胞間，也可以發(fā)生在異質(zhì)細胞間。對這一現(xiàn)象的描述可以追溯到近一百年前，但大多限于現(xiàn)象的報道，直到近年關(guān)于腫瘤細胞cell-in-cell胞內(nèi)死亡被重新命名為entosis[1]，并認為這是一類新型細胞死亡方式，這一現(xiàn)象才重新被認識，并快速成為一個新的研究 熱點‖。 論文作者所在研究團隊30年前就發(fā)現(xiàn)：NK細胞可以鉆入瘤細胞，并從內(nèi)部殺傷靶細胞，但其自身命運是在瘤細胞內(nèi)自身降解，而且具有凋亡的典型特征[2]；論文作者在碩士研究期間再次證實了這一發(fā)現(xiàn)，并進一步發(fā)現(xiàn)NK細胞在瘤細胞內(nèi)的死亡是caspase通路依賴性死亡[3]，既不同于近年新發(fā)現(xiàn)的同質(zhì)腫瘤細胞間發(fā)生的細胞溶酶體通路的細胞胞內(nèi)死亡-entosis,也不同于細胞自食現(xiàn)象（cannibalism）中瘤細胞 吃‖免疫細胞的過程，被學(xué)者認為是一種新的細胞胞內(nèi)死亡現(xiàn)象[4]，我們稱之為emtosis（emperipolesis+entosis）。 在此基礎(chǔ)上，我們進一步擴大對各類不同細胞間發(fā)生的cell-in-cell現(xiàn)象進行了探討，對同質(zhì)和異質(zhì)細胞間，特別是免疫細胞-瘤細胞間發(fā)生的細胞胞內(nèi)死亡進行了比較，并重點解析了emtosis形成的機制。此外對于免疫細胞與腫瘤細胞相互作用產(chǎn)生的cell-in-cell現(xiàn)象的臨床生物學(xué)意義也開展了初步的研究，旨在探索cell-in-cell與臨床疾病發(fā)生的關(guān)系。 研究的主要結(jié)果如下：細胞胞內(nèi)死亡是cell-in-cell現(xiàn)象的主要結(jié)果，在同質(zhì)腫瘤細胞或異質(zhì)腫瘤細胞間發(fā)生的細胞胞內(nèi)死亡主要是溶酶體介導(dǎo)的死亡模式（entosis），而免疫細胞特別是殺傷細胞與腫瘤細胞之間甚至正常細胞之間發(fā)生的細胞胞內(nèi)死亡主要是caspase依賴的凋亡模式（emtosis），但不具備殺傷活性的正常免疫細胞或白血病細胞（B細胞、CCRF、Raji等）在腫瘤細胞內(nèi)細胞胞內(nèi)死亡也是溶酶介導(dǎo)的死亡模式即entosis。以上研究結(jié)果說明，細胞胞內(nèi)死亡模式并不限于同質(zhì)或異質(zhì)細胞的相互作用，可能與細胞自身特定的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。 由于entosis研究所采用的瘤細胞MCF7是一株caspase3缺陷細胞[5,6]，因此在該細胞系間發(fā)生的溶酶體介導(dǎo)的細胞胞內(nèi)死亡（entosis）可能與其caspase3基因缺陷有關(guān)[7]。因此，我們分別將此細胞系用于entosis和emtosis的兩對瘤細胞之一進行了比較研究。研究結(jié)果證實，無論在DNA和mRNA水平、還是在蛋白質(zhì)水平，MCF7的確是一株caspase3基因缺陷株，不能被經(jīng)典的凋亡誘導(dǎo)劑staurosporine誘導(dǎo)出現(xiàn)凋亡的各項特征。相反，在emtosis研究中所采用的非caspase3基因缺陷的靶細胞A431株可以被誘導(dǎo)呈現(xiàn)為典型的凋亡特征。兩種細胞都可以發(fā)生高比例的cell-in-cell現(xiàn)象，主要特征也是細胞胞內(nèi)死亡，兩種細胞出現(xiàn)的細胞胞內(nèi)死亡均具備典型的entosis特征，與其是否存在caspase3基因缺陷無關(guān)。相反，無論進入MCF7還是A431的NK細胞所發(fā)生的細胞胞內(nèi)死亡均為典型的caspase依賴的凋亡，即emtosis，提示胞內(nèi)細胞以何種形式死亡取決于進入細胞的性質(zhì)和特征。 在上述基礎(chǔ)上我們分別對entosis與emtosis形成的機制進行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)生entosis胞內(nèi)死亡模式的細胞內(nèi)有氧自由基的明顯聚集，并且有線粒體凋亡通路的凋亡因子細胞色素C的釋放；胞內(nèi)細胞和cell-in-cell的空泡結(jié)構(gòu)上有自噬標志性蛋白LC3的聚集；溶酶體功能被抑制后的胞內(nèi)細胞死亡模式可以從entosis轉(zhuǎn)換成emtosis，并且細胞死亡速度明顯提前。以上的證據(jù)提示entosis實際上是一個自噬的過程，通過啟動自噬通路來抵抗cell-in-cell后內(nèi)部環(huán)境造成的凋亡啟動，，以此來獲得生存機會，然而持續(xù)擴大的自噬行為最終將細胞降解，這一初步結(jié)果與2011年Overholtzer實驗室研究結(jié)論是一致的。但對emtosis機制的研究與entosis有完全不同的結(jié)論。我們的研究表明：不同的免疫細胞在腫瘤細胞內(nèi)發(fā)生不同的細胞胞內(nèi)死亡是與其是否具備殺傷活性密切相關(guān)，只有殺傷活性的免疫細胞發(fā)生的細胞胞內(nèi)死亡具備emtosis的特征。進一步采用免疫熒光、顆粒酶B活性抑制劑和顆粒酶B缺陷小鼠來源的殺傷細胞對emtosis的形成機制進行了深入研究。結(jié)果表明：（1）無論由人體新鮮分離制備的，還是白血病細胞系來源的免疫樣細胞，只有表達顆粒酶B、并具有殺傷活性的免疫細胞才會出現(xiàn)emtosis，而不表達顆粒酶B的免疫細胞如Ｂ細胞、單核細胞等只能發(fā)生entosis。（2）顆粒酶B抑制劑處理對emtosis具有非常顯著的抑制作用，顆粒酶B缺陷小鼠的LAK細胞發(fā)生的emtosis時間上也出現(xiàn)明顯延遲。（3）動態(tài)觀察也發(fā)現(xiàn)進入靶細胞內(nèi)的殺傷細胞可以釋放具有活性的顆粒酶B，但顆粒酶B大部分聚集在其自身周圍，與靶細胞外殺傷細胞的顆粒酶B擴散至靶細胞胞漿內(nèi)呈明顯反差。因此推測emtosis很可能是由進入胞內(nèi)的殺傷細胞自我分泌的顆粒酶B 反殺‖所致，這種殺傷細胞的細胞胞內(nèi)死亡既可能是一種殺傷過程中的 誤傷 ，也可能是殺傷細胞自身一種新的平衡和自穩(wěn)機制。 此外，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)cell-in-cell所導(dǎo)致的效應(yīng)細胞和靶細胞的命運是多樣的，產(chǎn)生的后果也是多樣的：免疫細胞進入腫瘤細胞，或進入正常細胞能明顯導(dǎo)致靶細胞形成多核的異倍體細胞；cell-in-cell現(xiàn)象在體外發(fā)生的幾率比預(yù)期的要高，在所篩選的近百余種細胞系中，逾70%的細胞可以出現(xiàn)cell-in-cell現(xiàn)象，而且cell-in-cell還廣泛出現(xiàn)在體內(nèi)包括腫瘤與其癌旁組織在內(nèi)的各類炎癥組織中，為進一步研究cell-in-cell的臨床生物學(xué)意義提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

【共引文獻】

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本文編號：2357510