【摘要】：第一部分巰乙磺酸鈉對(duì)大腸桿菌生物膜早期黏附及胞外聚合物的影響 【目的】研究巰乙磺酸鈉對(duì)大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)早期黏附及胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS)的影響。 【方法】瓊脂平板稀釋法檢測(cè)巰乙磺酸鈉對(duì)大腸桿菌ATCC25922的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)；采用了平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)高濃度、低濃度巰乙磺酸鈉（2mg/ml、0.5mg/ml）在不同時(shí)間點(diǎn)(2、4、6、8h)對(duì)大腸桿菌黏附的影響；采用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記多糖和細(xì)茵，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)定性觀察細(xì)菌黏附及胞外多糖變化；利用硫酸-苯酚法定量各組細(xì)菌胞外多糖的產(chǎn)量；利用考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法(Bradford法)測(cè)定胞外蛋白含量。 【結(jié)果】巰乙磺酸鈉干預(yù)2、4、6、8h后，與生理鹽水對(duì)照組比較，各組黏附細(xì)菌數(shù)均有所減少（F值分別為31.038、11.180、80.686、10.362，P 0.05）,高濃度組較低濃度組更明顯（P 0.05）；經(jīng)巰乙磺酸鈉干預(yù)8h后，經(jīng)FITC-ConA和PI雙染，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察見菌落稀疏，散在分布，胞外多糖減少,稀薄，以高濃度為甚；胞外多糖定量實(shí)驗(yàn)中，胞外多糖（μg）/細(xì)菌干重（mg）在高濃度組為(13.57±0.59)，在低濃度組為（27.77±0.77），分別與生理鹽水對(duì)照組(35.73±0.44)比較，均降低了胞外多糖的產(chǎn)生（F=3332.150,P0.05），高濃度組較低濃度組更明顯（P0.05）；胞外蛋白定量實(shí)驗(yàn)中，胞外蛋白（μg）/細(xì)菌干重（mg）在高濃度組為(7.76±0.32)，在低濃度組為（17.59±0.86），分別與生理鹽水對(duì)照組(23.31±1.36)比較，均降低了胞外蛋白的產(chǎn)生（F=688.129,P 0.05），高濃度組較低濃度組更明顯（P0.05）。 【結(jié)論】巰乙磺酸鈉能顯著減少大腸桿菌生物膜的早期黏附，也能減少大腸桿菌生物膜胞外多糖及胞外蛋白的生成。 第二部分巰乙磺酸鈉對(duì)大腸桿菌生物膜形成的影響以及單獨(dú)和聯(lián)合環(huán)丙沙星大腸桿菌BF的作用 【目的】研究巰乙磺酸鈉對(duì)大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)形成的影響，以及單獨(dú)及聯(lián)合環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)對(duì)成熟大腸桿菌BF的作用。 【方法】瓊脂平板稀釋法檢測(cè)CIP對(duì)大腸桿菌ATCC25922的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)；掃描電鏡觀察巰乙磺酸鈉對(duì)大腸桿菌BF形成的作用；平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)巰乙磺酸鈉單獨(dú)及與CIP聯(lián)用后BF內(nèi)活菌數(shù)；用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanningmicroscopy，CLSM)觀察巰乙磺酸鈉對(duì)成熟的大腸桿菌BF空間結(jié)構(gòu)的影響并結(jié)合BF圖像結(jié)構(gòu)分析軟件(image structure analyer，ISA)定量分析BF結(jié)構(gòu)參數(shù)。 【結(jié)果】 CIP對(duì)大腸桿菌ATCC25922的MIC是0.25μg/ml；巰乙磺酸鈉能減少BF中基質(zhì)樣物質(zhì)以及被膜的厚度；單用巰乙磺酸鈉，8mg/ml才能使BF中的活菌數(shù)減少(P0.05)，單用CIP，1MIC才可使BF中活菌數(shù)降低(P0.05)，小劑量巰乙磺酸鈉(1mg/ml)與1/2MIC的CIP聯(lián)合應(yīng)用就可使BF上的活菌數(shù)明顯減少(P0.05)；CLSM圖像顯示經(jīng)巰乙磺酸鈉作用后的BF厚度逐漸減少，，密度逐漸稀疏；ISA軟件定量分析顯示：5mg/ml巰乙磺酸鈉作用后，BF厚度變�。‵=67.880，P0.05）、平均擴(kuò)散距離(average diffusion distance，ADD)(F=15.977，P0.05)和結(jié)構(gòu)熵（textual entropy，TE)均減少(F=39.432，P0.05)，區(qū)域孔率(areal porosity，AP)增加(F=25.100，P0.05)，2mg/ml巰乙磺酸鈉干預(yù)后效果不如高濃度明顯。 【結(jié)論】巰乙磺酸鈉能夠抑制大腸桿菌BF形成，也能破壞成熟大腸桿菌BF形態(tài)結(jié)構(gòu)；巰乙磺酸鈉與環(huán)丙沙星存在協(xié)同作用，增強(qiáng)其抗大腸桿菌生物膜的能力。 第三部分巰乙磺酸鈉對(duì)留置導(dǎo)尿管大腸桿菌生物膜的體內(nèi)干預(yù)作用 【目的】構(gòu)建留置導(dǎo)尿管大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)體內(nèi)模型；研究巰乙磺酸鈉（Mesna）對(duì)留置導(dǎo)尿管大腸桿菌BF的的體內(nèi)干預(yù)作用及對(duì)導(dǎo)尿管相關(guān)性尿路感染(catheter-associated urinary tract infections，CAUTI)的影響。 【方法】1、構(gòu)建留置導(dǎo)尿管大腸桿菌BF體內(nèi)模型，分為模型組及對(duì)照組，家兔行導(dǎo)尿術(shù)，模型組家兔經(jīng)導(dǎo)尿管注入大腸桿菌菌液4天，掃描電鏡(SEM)及平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)留置導(dǎo)尿管大腸桿菌BF動(dòng)物模型構(gòu)建情況；2、巰乙磺酸鈉對(duì)導(dǎo)尿管大腸桿菌BF的體內(nèi)干預(yù)作用，建立留置導(dǎo)尿管大腸桿菌BF體內(nèi)模型后，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、生理鹽水（NS）組（NS,5ml,膀胱灌注，2次/日）、Mesna組（mesna,20mg/ml×5ml,膀胱灌注，2次/日）、頭孢他啶（CAZ）組（CAZ,50mg/kg，靜滴，2次/日）、Mesna+CAZ組（mesna,20mg/ml×5ml,膀胱灌注，2次/日+CAZ50mg/kg，靜滴，2次/日），每日取尿袋內(nèi)尿液行菌落計(jì)數(shù)，3天后處死家兔，掃描電鏡(SEM)觀察導(dǎo)尿管表面大腸桿菌BF形態(tài)改變，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)導(dǎo)尿管表面及膀胱壁黏附細(xì)菌數(shù)，HE染色觀察膀胱組織病理改變，ELISA檢測(cè)血漿中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。 【結(jié)果】1、在建立模型實(shí)驗(yàn)中，模型組可見大量細(xì)菌在導(dǎo)尿管上呈團(tuán)狀或膜狀黏附生長(zhǎng)，厚薄不均的黏液狀物質(zhì)連接成一大片，平均菌落計(jì)數(shù)模型組為(4.78±0.28)(Log10CFU)較對(duì)照組(1.05±0.10)(Log10CFU)明顯增多(t=17.44，P0.01)；2、在干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，Mesna組在第二天能使尿袋中細(xì)菌減少；Mesna組較CAZ組更明顯地破壞了留置導(dǎo)尿管表面大腸桿菌BF形態(tài)及減少了導(dǎo)尿管上細(xì)菌數(shù)；Mesna組及CAZ組均能使膀胱壁黏附細(xì)菌數(shù)減少，聯(lián)合治療組更明顯；對(duì)照組及NS組可見膀胱粘膜破損，粘膜細(xì)胞充血、水腫，大量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；Mesna組及CAZ組黏附完好，細(xì)胞充血、水腫減輕，炎癥細(xì)胞少；聯(lián)合治療組黏膜完好，細(xì)胞充血、水腫進(jìn)一步減輕，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)進(jìn)一步減少；對(duì)照組、NS組、Mesna組、CAZ組及Mesna+CAZ組IL-1β含量分別為397.97±100.75、402.87±109.81、287.35±65.05、257.81±78.36、138.61±55.71（pg/ml）（F=12.650, P0.05）， TNF-α的含量分別為525.30±81.09、491.94±138.54、251.12±79.51、254.60±78.36、135.68±46.77（pg/ml）（F=28.207, P0.05）IL-6的含量的分別為840.60±106.92、837.39±120.67、556.17±108.57、446.32±129.33、188.54±43.65（pg/ml）（F=54.184, P0.05），巰乙磺酸鈉降低了IL-1β、TNF-α、IL-6水平，聯(lián)合治療更明顯。 【結(jié)論】留置導(dǎo)尿管表面大腸桿菌BF動(dòng)物模型成功建立；巰乙磺酸鈉對(duì)體內(nèi)留置導(dǎo)尿管表面大腸桿菌BF有破壞作用，能降低細(xì)菌對(duì)膀胱的黏附，并能減輕膀胱病理變化，減輕由IL-1β、TNF-α、IL-6導(dǎo)致的尿路免疫損傷，聯(lián)合頭孢他啶治療作用更明顯。 第四部分巰乙磺酸鈉對(duì)大腸桿菌黏附蛋白及胞外多糖生成相關(guān)基因的作用 【目的】研究不同濃度巰乙磺酸鈉對(duì)大腸桿菌flu、fimH、papC、glmS、glmU、msbB、 IpxA基因表達(dá)的作用，為巰乙磺酸鈉抗大腸桿菌生物膜作用提供機(jī)制。 【方法】實(shí)驗(yàn)分為四組：對(duì)照組、巰乙磺酸鈉0.5mg/ml組、巰乙磺酸鈉2mg/ml組、巰乙磺酸鈉5mg/ml組；將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌ATCC25922菌液稀釋至OD（600）=0.05,分別加入相同體積的LB培養(yǎng)基、0.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的巰乙磺酸鈉，2h后收集菌液。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組基因的相對(duì)表達(dá)量。 【結(jié)果】與對(duì)照組相比，巰乙磺酸鈉0.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml組的flu基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.587±0.058、0.334±0.054、0.480±0.075，2mg/ml時(shí)最低，5mg/ml則較2mg/ml組升高; fimH基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.601±0.014、0.370±0.064、0.407±0.056在2mg/ml、5mg/ml時(shí)降低明顯（P 0.05）;papC基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.628±0.06、0.278±0.072、0.30±0.0053，在2mg/ml和5mg/ml組較0.5mg/ml組明顯下降（P 0.05）；glmS基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.624±0.105、0.378±0.085、0.469±0.105，在2mg/ml、5mg/ml時(shí)最低（P 0.05）;glmU基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.585±0.062、0.285±0.075、0.172±0.007，隨濃度升高表達(dá)下降，在5mg/ml時(shí)下降最明顯（P 0.05）；msbB基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.697±0.096、0.52±0.088、0.36±0.045，并隨濃度升高表達(dá)下降，5mg/ml時(shí)下降最明顯（P 0.05）;lpxA基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.937±0.146、0.632±0.125、0.761±0.09，在0.5mg/ml組與對(duì)照組比較無顯著性差異，但在2mg/ml、5mg/ml時(shí)均出現(xiàn)下降（P 0.05），2mg/ml組更明顯（P 0.05）。 【結(jié)論】巰乙磺酸鈉抑制了大腸桿菌于黏附有關(guān)的flu、fimH、papC基因的表達(dá)，也抑制了與多糖生成有關(guān)的glmS、 glmU、msbB、 IpxA基因的表達(dá)；不同濃度巰乙磺酸鈉對(duì)其抑制作用不同，并不隨濃度增高而增強(qiáng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鄒志慧;余加林;劉官信;李芳;林麗華;林雅茵;;納米銀離子對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的細(xì)菌死亡率的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年14期

2 胡建娥;夏云;;肽核酸體外抑制銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年03期

本文編號(hào)：2354655