【摘要】：第一部分巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜早期黏附及胞外聚合物的影響 【目的】研究巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)早期黏附及胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS)的影響。 【方法】瓊脂平板稀釋法檢測巰乙磺酸鈉對大腸桿菌ATCC25922的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)；采用了平板菌落計數(shù)法檢測高濃度、低濃度巰乙磺酸鈉（2mg/ml、0.5mg/ml）在不同時間點(2、4、6、8h)對大腸桿菌黏附的影響；采用免疫熒光技術(shù)標記多糖和細茵，利用激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)定性觀察細菌黏附及胞外多糖變化；利用硫酸-苯酚法定量各組細菌胞外多糖的產(chǎn)量；利用考馬斯亮藍染料結(jié)合法(Bradford法)測定胞外蛋白含量。 【結(jié)果】巰乙磺酸鈉干預2、4、6、8h后，與生理鹽水對照組比較，各組黏附細菌數(shù)均有所減少（F值分別為31.038、11.180、80.686、10.362，P 0.05）,高濃度組較低濃度組更明顯（P 0.05）；經(jīng)巰乙磺酸鈉干預8h后，經(jīng)FITC-ConA和PI雙染，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察見菌落稀疏，散在分布，胞外多糖減少,稀薄，以高濃度為甚；胞外多糖定量實驗中，胞外多糖（μg）/細菌干重（mg）在高濃度組為(13.57±0.59)，在低濃度組為（27.77±0.77），分別與生理鹽水對照組(35.73±0.44)比較，均降低了胞外多糖的產(chǎn)生（F=3332.150,P0.05），高濃度組較低濃度組更明顯（P0.05）；胞外蛋白定量實驗中，胞外蛋白（μg）/細菌干重（mg）在高濃度組為(7.76±0.32)，在低濃度組為（17.59±0.86），分別與生理鹽水對照組(23.31±1.36)比較，均降低了胞外蛋白的產(chǎn)生（F=688.129,P 0.05），高濃度組較低濃度組更明顯（P0.05）。 【結(jié)論】巰乙磺酸鈉能顯著減少大腸桿菌生物膜的早期黏附，也能減少大腸桿菌生物膜胞外多糖及胞外蛋白的生成。 第二部分巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜形成的影響以及單獨和聯(lián)合環(huán)丙沙星大腸桿菌BF的作用 【目的】研究巰乙磺酸鈉對大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)形成的影響，以及單獨及聯(lián)合環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)對成熟大腸桿菌BF的作用。 【方法】瓊脂平板稀釋法檢測CIP對大腸桿菌ATCC25922的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)；掃描電鏡觀察巰乙磺酸鈉對大腸桿菌BF形成的作用；平板計數(shù)法檢測巰乙磺酸鈉單獨及與CIP聯(lián)用后BF內(nèi)活菌數(shù)；用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanningmicroscopy，CLSM)觀察巰乙磺酸鈉對成熟的大腸桿菌BF空間結(jié)構(gòu)的影響并結(jié)合BF圖像結(jié)構(gòu)分析軟件(image structure analyer，ISA)定量分析BF結(jié)構(gòu)參數(shù)。 【結(jié)果】 CIP對大腸桿菌ATCC25922的MIC是0.25μg/ml；巰乙磺酸鈉能減少BF中基質(zhì)樣物質(zhì)以及被膜的厚度；單用巰乙磺酸鈉，8mg/ml才能使BF中的活菌數(shù)減少(P0.05)，單用CIP，1MIC才可使BF中活菌數(shù)降低(P0.05)，小劑量巰乙磺酸鈉(1mg/ml)與1/2MIC的CIP聯(lián)合應用就可使BF上的活菌數(shù)明顯減少(P0.05)；CLSM圖像顯示經(jīng)巰乙磺酸鈉作用后的BF厚度逐漸減少，，密度逐漸稀疏；ISA軟件定量分析顯示：5mg/ml巰乙磺酸鈉作用后，BF厚度變�。‵=67.880，P0.05）、平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)(F=15.977，P0.05)和結(jié)構(gòu)熵（textual entropy，TE)均減少(F=39.432，P0.05)，區(qū)域孔率(areal porosity，AP)增加(F=25.100，P0.05)，2mg/ml巰乙磺酸鈉干預后效果不如高濃度明顯。 【結(jié)論】巰乙磺酸鈉能夠抑制大腸桿菌BF形成，也能破壞成熟大腸桿菌BF形態(tài)結(jié)構(gòu)；巰乙磺酸鈉與環(huán)丙沙星存在協(xié)同作用，增強其抗大腸桿菌生物膜的能力。 第三部分巰乙磺酸鈉對留置導尿管大腸桿菌生物膜的體內(nèi)干預作用 【目的】構(gòu)建留置導尿管大腸桿菌生物膜(biofilm，BF)體內(nèi)模型；研究巰乙磺酸鈉（Mesna）對留置導尿管大腸桿菌BF的的體內(nèi)干預作用及對導尿管相關(guān)性尿路感染(catheter-associated urinary tract infections，CAUTI)的影響。 【方法】1、構(gòu)建留置導尿管大腸桿菌BF體內(nèi)模型，分為模型組及對照組，家兔行導尿術(shù)，模型組家兔經(jīng)導尿管注入大腸桿菌菌液4天，掃描電鏡(SEM)及平板計數(shù)法檢測留置導尿管大腸桿菌BF動物模型構(gòu)建情況；2、巰乙磺酸鈉對導尿管大腸桿菌BF的體內(nèi)干預作用，建立留置導尿管大腸桿菌BF體內(nèi)模型后，實驗分為對照組、生理鹽水（NS）組（NS,5ml,膀胱灌注，2次/日）、Mesna組（mesna,20mg/ml×5ml,膀胱灌注，2次/日）、頭孢他啶（CAZ）組（CAZ,50mg/kg，靜滴，2次/日）、Mesna+CAZ組（mesna,20mg/ml×5ml,膀胱灌注，2次/日+CAZ50mg/kg，靜滴，2次/日），每日取尿袋內(nèi)尿液行菌落計數(shù)，3天后處死家兔，掃描電鏡(SEM)觀察導尿管表面大腸桿菌BF形態(tài)改變，平板菌落計數(shù)法檢測導尿管表面及膀胱壁黏附細菌數(shù)，HE染色觀察膀胱組織病理改變，ELISA檢測血漿中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。 【結(jié)果】1、在建立模型實驗中，模型組可見大量細菌在導尿管上呈團狀或膜狀黏附生長，厚薄不均的黏液狀物質(zhì)連接成一大片，平均菌落計數(shù)模型組為(4.78±0.28)(Log10CFU)較對照組(1.05±0.10)(Log10CFU)明顯增多(t=17.44，P0.01)；2、在干預實驗中，Mesna組在第二天能使尿袋中細菌減少；Mesna組較CAZ組更明顯地破壞了留置導尿管表面大腸桿菌BF形態(tài)及減少了導尿管上細菌數(shù)；Mesna組及CAZ組均能使膀胱壁黏附細菌數(shù)減少，聯(lián)合治療組更明顯；對照組及NS組可見膀胱粘膜破損，粘膜細胞充血、水腫，大量炎癥細胞侵潤；Mesna組及CAZ組黏附完好，細胞充血、水腫減輕，炎癥細胞少；聯(lián)合治療組黏膜完好，細胞充血、水腫進一步減輕，炎癥細胞侵潤進一步減少；對照組、NS組、Mesna組、CAZ組及Mesna+CAZ組IL-1β含量分別為397.97±100.75、402.87±109.81、287.35±65.05、257.81±78.36、138.61±55.71（pg/ml）（F=12.650, P0.05）， TNF-α的含量分別為525.30±81.09、491.94±138.54、251.12±79.51、254.60±78.36、135.68±46.77（pg/ml）（F=28.207, P0.05）IL-6的含量的分別為840.60±106.92、837.39±120.67、556.17±108.57、446.32±129.33、188.54±43.65（pg/ml）（F=54.184, P0.05），巰乙磺酸鈉降低了IL-1β、TNF-α、IL-6水平，聯(lián)合治療更明顯。 【結(jié)論】留置導尿管表面大腸桿菌BF動物模型成功建立；巰乙磺酸鈉對體內(nèi)留置導尿管表面大腸桿菌BF有破壞作用，能降低細菌對膀胱的黏附，并能減輕膀胱病理變化，減輕由IL-1β、TNF-α、IL-6導致的尿路免疫損傷，聯(lián)合頭孢他啶治療作用更明顯。 第四部分巰乙磺酸鈉對大腸桿菌黏附蛋白及胞外多糖生成相關(guān)基因的作用 【目的】研究不同濃度巰乙磺酸鈉對大腸桿菌flu、fimH、papC、glmS、glmU、msbB、 IpxA基因表達的作用，為巰乙磺酸鈉抗大腸桿菌生物膜作用提供機制。 【方法】實驗分為四組：對照組、巰乙磺酸鈉0.5mg/ml組、巰乙磺酸鈉2mg/ml組、巰乙磺酸鈉5mg/ml組；將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌ATCC25922菌液稀釋至OD（600）=0.05,分別加入相同體積的LB培養(yǎng)基、0.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml的巰乙磺酸鈉，2h后收集菌液。運用實時定量PCR檢測各組基因的相對表達量。 【結(jié)果】與對照組相比，巰乙磺酸鈉0.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml組的flu基因的相對表達量分別為0.587±0.058、0.334±0.054、0.480±0.075，2mg/ml時最低，5mg/ml則較2mg/ml組升高; fimH基因的相對表達量分別為0.601±0.014、0.370±0.064、0.407±0.056在2mg/ml、5mg/ml時降低明顯（P 0.05）;papC基因的相對表達量分別為0.628±0.06、0.278±0.072、0.30±0.0053，在2mg/ml和5mg/ml組較0.5mg/ml組明顯下降（P 0.05）；glmS基因的相對表達量分別為0.624±0.105、0.378±0.085、0.469±0.105，在2mg/ml、5mg/ml時最低（P 0.05）;glmU基因的相對表達量分別為0.585±0.062、0.285±0.075、0.172±0.007，隨濃度升高表達下降，在5mg/ml時下降最明顯（P 0.05）；msbB基因的相對表達量分別為0.697±0.096、0.52±0.088、0.36±0.045，并隨濃度升高表達下降，5mg/ml時下降最明顯（P 0.05）;lpxA基因的相對表達量分別為0.937±0.146、0.632±0.125、0.761±0.09，在0.5mg/ml組與對照組比較無顯著性差異，但在2mg/ml、5mg/ml時均出現(xiàn)下降（P 0.05），2mg/ml組更明顯（P 0.05）。 【結(jié)論】巰乙磺酸鈉抑制了大腸桿菌于黏附有關(guān)的flu、fimH、papC基因的表達，也抑制了與多糖生成有關(guān)的glmS、 glmU、msbB、 IpxA基因的表達；不同濃度巰乙磺酸鈉對其抑制作用不同，并不隨濃度增高而增強。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R378

【參考文獻】

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1 鄒志慧;余加林;劉官信;李芳;林麗華;林雅茵;;納米銀離子對銅綠假單胞菌生物被膜的細菌死亡率的影響[J];第三軍醫(yī)大學學報;2009年14期

2 胡建娥;夏云;;肽核酸體外抑制銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的研究[J];第三軍醫(yī)大學學報;2011年03期

本文編號：2354655