【摘要】：抗原表位(epitope),又稱抗原決定簇(antigenic determinant,AD)指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán),抗原以此與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面的受體結(jié)合,進(jìn)而引發(fā)免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)。 抗原-抗體的相互作用是免疫反應(yīng)的核心。一系列研究工作表明,表位的精確定位,在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用,如合理設(shè)計疫苗、設(shè)計及篩選新型藥物、研發(fā)新的診斷試劑和免疫治療策略的發(fā)展中至關(guān)重要。 隨著現(xiàn)代實驗技術(shù)的發(fā)展,目前通常利用重疊肽段覆蓋整個抗原序列來判定抗原表位。然而,抗體表位作圖一直受限于高昂的成本和進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)解析所耗費的大量時間投入。 近年來,隨著抗原-抗體復(fù)合物的解析技術(shù)不斷完善,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中包含的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)不斷增加。伴隨生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,由于抗體序列、結(jié)構(gòu)的高度保守,可以通過計算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)合理確定抗原表位特征,揭示免疫分子識別新的特征。 在我們的研究中,將TNF-α、C5a作為研究對象,選擇自主研發(fā)的具有中和活性的抗TNF-α人源抗體TGMB、抗C5a鼠源抗體P29、F20,基于抗原(TNF-α、C5a)晶體結(jié)構(gòu)以及理論模擬獲得的抗體片段Fv的三維構(gòu)象,借助計算機(jī)輔助分子對接技術(shù)、動力學(xué)模擬技術(shù)構(gòu)建抗原-抗體相互作用的復(fù)合物模型,利用分子生物學(xué)突變實驗以及功能評價方法對理論預(yù)測的抗原表位進(jìn)行實驗驗證。具體工作如下: 1、利用計算機(jī)同源模建、分子對接以及動力學(xué)模擬從理論上構(gòu)建TNF-α與抗體TGMB相互作用空間結(jié)構(gòu),合理預(yù)測TGMB特異性識別TNF-α的關(guān)鍵位置,通過定點突變技術(shù)對理論預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗證。 作為一種多功能的細(xì)胞因子,TNF-α參與許多重要的生理功能。然而,TNF-α的過表達(dá)會破壞機(jī)體的免疫平衡,與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Crohn’s病等多種疾病密切相關(guān)。擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的TGMB是一株具有良好中和活性的人源抗TNF抗體,其識別TNF表位及作用模式尚不清楚。本研究中,基于獲得的TGMB可變區(qū)序列,通過計算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)搭建抗體TGMB可變區(qū)Fv三維結(jié)構(gòu),并通過力學(xué)優(yōu)化確定其穩(wěn)定的空間構(gòu)象。利用已解析的TNFα晶體結(jié)構(gòu),通過分子對接獲得TGMB-Fv片段與TNFα相互作用的復(fù)合物模型,經(jīng)計算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)、計算生物學(xué)相關(guān)理論,預(yù)測抗原抗體相互識別區(qū)域、關(guān)鍵氨基酸殘基及作用模式;根據(jù)突變體序列設(shè)計引物,利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,構(gòu)建相應(yīng)的突變體原核表達(dá)載體進(jìn)行蛋白表達(dá),通過ELISA、蛋白相互作用和功能檢測實驗等手段對突變體進(jìn)行評價,驗證功能位點。結(jié)果證明與理論預(yù)測一致。 2、針對自主研發(fā)的中和性抗C5a鼠源抗體F20、P29,利用計算機(jī)輔助同源模建技術(shù)搭建抗體可變區(qū)的空間構(gòu)象;借助C5a的晶體結(jié)構(gòu),通過分子對接、動力學(xué)模擬從理論上預(yù)測抗體F20、P29特異性識別C5a的表位結(jié)構(gòu);在合理預(yù)測其表位結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用生物學(xué)實驗技術(shù)對理論模型進(jìn)行驗證,確定其相互作用的合理模式。 C5a是動物血清中的補體系統(tǒng)在激活過程中的一個裂解片段,是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)和趨化因子,具有廣泛的生物學(xué)功能。在急性肺損傷、膿毒血癥、腦膜炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎等病理過程中起重要作用。如在敗血癥的發(fā)病過程中存在補體系統(tǒng)的過渡活化,機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)了大量C5a,在大鼠和小鼠的敗血癥模型中,已經(jīng)證明體內(nèi)用C5a抗體阻斷C5a可以明顯提高動物的生存率。 本研究中,通過計算機(jī)輔助分子模擬對鼠源抗體F20、P29可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理搭建,并通過力學(xué)優(yōu)化獲得其穩(wěn)定的三維構(gòu)象。利用已解析的C5a晶體結(jié)構(gòu),通過分子對接分別獲得F20片段、P29片段與C5a相互作用的復(fù)合物模型,經(jīng)計算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)、計算生物學(xué)相關(guān)理論,預(yù)測抗原抗體相互識別區(qū)域,關(guān)鍵氨基酸殘基、理論上確定抗原的功能表位。然后利用利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,構(gòu)建相應(yīng)的突變體原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)純化,通過ELISA、分子相互結(jié)合的動力學(xué)分析等手段評價突變體的結(jié)合能力。同時,在細(xì)胞水平,對突變體的功能活性進(jìn)行評價,確定功能位點。 本研究成功地運用計算機(jī)輔助分子模擬技術(shù),探討抗原與功能抗體的作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)來合理判定抗原功能表位。主要結(jié)果有:1、利用分子模擬技術(shù)構(gòu)建了TNF/TGMB的復(fù)合物結(jié)構(gòu),合理預(yù)測了TNF的關(guān)鍵功能表位D143,并通過分子生物學(xué)突變技術(shù)、ELISA、蛋白相互作用和細(xì)胞水平的功能實驗進(jìn)行了驗證,證明了預(yù)測結(jié)果的合理性。2、首先借助蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象特征,利用計算機(jī)輔助分子模擬對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行研究,合理預(yù)測了蛋白質(zhì)潛在的功能表位。進(jìn)一步借助北京天廣實生物技術(shù)股份有限公司獲得的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的鼠源抗體F20、P29,通過計算機(jī)輔助分子模擬技術(shù),利用分子對接、計算機(jī)圖形學(xué)方法合理預(yù)測C5a的功能性抗原表位。進(jìn)而通過分子生物學(xué)突變技術(shù)構(gòu)建C5a突變體,借助ELISA、蛋白相互作用等驗證F20、P29識別C5a核心結(jié)合位點,利用建立的C5a功能檢測平臺對突變體進(jìn)行活性評價,確定D31、R37、K68核心結(jié)合位點的生物學(xué)功能,驗證理論預(yù)測的結(jié)果,同時證明了方法的合理性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2347665