【摘要】：抗原表位(epitope),又稱(chēng)抗原決定簇(antigenic determinant,AD)指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán),抗原以此與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面的受體結(jié)合,進(jìn)而引發(fā)免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)。 抗原-抗體的相互作用是免疫反應(yīng)的核心。一系列研究工作表明,表位的精確定位,在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用,如合理設(shè)計(jì)疫苗、設(shè)計(jì)及篩選新型藥物、研發(fā)新的診斷試劑和免疫治療策略的發(fā)展中至關(guān)重要。 隨著現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,目前通常利用重疊肽段覆蓋整個(gè)抗原序列來(lái)判定抗原表位。然而,抗體表位作圖一直受限于高昂的成本和進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)解析所耗費(fèi)的大量時(shí)間投入。 近年來(lái),隨著抗原-抗體復(fù)合物的解析技術(shù)不斷完善,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)中包含的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)不斷增加。伴隨生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,由于抗體序列、結(jié)構(gòu)的高度保守,可以通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)合理確定抗原表位特征,揭示免疫分子識(shí)別新的特征。 在我們的研究中,將TNF-α、C5a作為研究對(duì)象,選擇自主研發(fā)的具有中和活性的抗TNF-α人源抗體TGMB、抗C5a鼠源抗體P29、F20,基于抗原(TNF-α、C5a)晶體結(jié)構(gòu)以及理論模擬獲得的抗體片段Fv的三維構(gòu)象,借助計(jì)算機(jī)輔助分子對(duì)接技術(shù)、動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)構(gòu)建抗原-抗體相互作用的復(fù)合物模型,利用分子生物學(xué)突變實(shí)驗(yàn)以及功能評(píng)價(jià)方法對(duì)理論預(yù)測(cè)的抗原表位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。具體工作如下: 1、利用計(jì)算機(jī)同源模建、分子對(duì)接以及動(dòng)力學(xué)模擬從理論上構(gòu)建TNF-α與抗體TGMB相互作用空間結(jié)構(gòu),合理預(yù)測(cè)TGMB特異性識(shí)別TNF-α的關(guān)鍵位置,通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)理論預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 作為一種多功能的細(xì)胞因子,TNF-α參與許多重要的生理功能。然而,TNF-α的過(guò)表達(dá)會(huì)破壞機(jī)體的免疫平衡,與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Crohn’s病等多種疾病密切相關(guān)。擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的TGMB是一株具有良好中和活性的人源抗TNF抗體,其識(shí)別TNF表位及作用模式尚不清楚。本研究中,基于獲得的TGMB可變區(qū)序列,通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)搭建抗體TGMB可變區(qū)Fv三維結(jié)構(gòu),并通過(guò)力學(xué)優(yōu)化確定其穩(wěn)定的空間構(gòu)象。利用已解析的TNFα晶體結(jié)構(gòu),通過(guò)分子對(duì)接獲得TGMB-Fv片段與TNFα相互作用的復(fù)合物模型,經(jīng)計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)、計(jì)算生物學(xué)相關(guān)理論,預(yù)測(cè)抗原抗體相互識(shí)別區(qū)域、關(guān)鍵氨基酸殘基及作用模式;根據(jù)突變體序列設(shè)計(jì)引物,利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,構(gòu)建相應(yīng)的突變體原核表達(dá)載體進(jìn)行蛋白表達(dá),通過(guò)ELISA、蛋白相互作用和功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)等手段對(duì)突變體進(jìn)行評(píng)價(jià),驗(yàn)證功能位點(diǎn)。結(jié)果證明與理論預(yù)測(cè)一致。 2、針對(duì)自主研發(fā)的中和性抗C5a鼠源抗體F20、P29,利用計(jì)算機(jī)輔助同源模建技術(shù)搭建抗體可變區(qū)的空間構(gòu)象;借助C5a的晶體結(jié)構(gòu),通過(guò)分子對(duì)接、動(dòng)力學(xué)模擬從理論上預(yù)測(cè)抗體F20、P29特異性識(shí)別C5a的表位結(jié)構(gòu);在合理預(yù)測(cè)其表位結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)理論模型進(jìn)行驗(yàn)證,確定其相互作用的合理模式。 C5a是動(dòng)物血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)在激活過(guò)程中的一個(gè)裂解片段,是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)和趨化因子,具有廣泛的生物學(xué)功能。在急性肺損傷、膿毒血癥、腦膜炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎等病理過(guò)程中起重要作用。如在敗血癥的發(fā)病過(guò)程中存在補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)渡活化,機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)了大量C5a,在大鼠和小鼠的敗血癥模型中,已經(jīng)證明體內(nèi)用C5a抗體阻斷C5a可以明顯提高動(dòng)物的生存率。 本研究中,通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分子模擬對(duì)鼠源抗體F20、P29可變區(qū)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理搭建,并通過(guò)力學(xué)優(yōu)化獲得其穩(wěn)定的三維構(gòu)象。利用已解析的C5a晶體結(jié)構(gòu),通過(guò)分子對(duì)接分別獲得F20片段、P29片段與C5a相互作用的復(fù)合物模型,經(jīng)計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)、計(jì)算生物學(xué)相關(guān)理論,預(yù)測(cè)抗原抗體相互識(shí)別區(qū)域,關(guān)鍵氨基酸殘基、理論上確定抗原的功能表位。然后利用利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,構(gòu)建相應(yīng)的突變體原核表達(dá)載體并進(jìn)行表達(dá)純化,通過(guò)ELISA、分子相互結(jié)合的動(dòng)力學(xué)分析等手段評(píng)價(jià)突變體的結(jié)合能力。同時(shí),在細(xì)胞水平,對(duì)突變體的功能活性進(jìn)行評(píng)價(jià),確定功能位點(diǎn)。 本研究成功地運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù),探討抗原與功能抗體的作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)來(lái)合理判定抗原功能表位。主要結(jié)果有:1、利用分子模擬技術(shù)構(gòu)建了TNF/TGMB的復(fù)合物結(jié)構(gòu),合理預(yù)測(cè)了TNF的關(guān)鍵功能表位D143,并通過(guò)分子生物學(xué)突變技術(shù)、ELISA、蛋白相互作用和細(xì)胞水平的功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證,證明了預(yù)測(cè)結(jié)果的合理性。2、首先借助蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象特征,利用計(jì)算機(jī)輔助分子模擬對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行研究,合理預(yù)測(cè)了蛋白質(zhì)潛在的功能表位。進(jìn)一步借助北京天廣實(shí)生物技術(shù)股份有限公司獲得的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的鼠源抗體F20、P29,通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù),利用分子對(duì)接、計(jì)算機(jī)圖形學(xué)方法合理預(yù)測(cè)C5a的功能性抗原表位。進(jìn)而通過(guò)分子生物學(xué)突變技術(shù)構(gòu)建C5a突變體,借助ELISA、蛋白相互作用等驗(yàn)證F20、P29識(shí)別C5a核心結(jié)合位點(diǎn),利用建立的C5a功能檢測(cè)平臺(tái)對(duì)突變體進(jìn)行活性評(píng)價(jià),確定D31、R37、K68核心結(jié)合位點(diǎn)的生物學(xué)功能,驗(yàn)證理論預(yù)測(cè)的結(jié)果,同時(shí)證明了方法的合理性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2347665