【摘要】：[研究背景]間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell, MSC)目前已從多種組織器官中分離得到,其多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)特性及不易形成畸胎瘤的安全性使其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室前期通過干細(xì)胞表面標(biāo)志Sca-1從小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryo fibroblasts, MEF)群體中分離純化出一類原始的間充質(zhì)干細(xì)胞亞群——Sca-1+CD117-Lin-細(xì)胞,其具有成脂成骨分化的能力,及抑制淋巴細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)特性。同時(shí),Sca-1+CD117-Lin-細(xì)胞還能夠在不添加任何外源性細(xì)胞因r的情況下誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(Hematopoietic progenitor cell, HPC)定向分化生成調(diào)節(jié)型樹突細(xì)胞(Dendritic cell, DC)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,并且從形態(tài)、表型和功能等方面研究了所誘導(dǎo)生成的調(diào)節(jié)型DC的生物學(xué)特性,初步闡明白介素10(Interleukin-10, IL-10)在此誘導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要作用,然而,IL-10的詳細(xì)作用機(jī)制尚不清楚。因此,本論文集中研究在MSC誘導(dǎo)的DC生成過程中IL-10發(fā)揮作用的信號(hào)通路及表觀調(diào)控等機(jī)制。 [研究目的]1.從MEF中分離純化MSC,并在體內(nèi)研究其免疫調(diào)節(jié)的特性,尤其對(duì)調(diào)節(jié)型DC生成的影響；2.研究IL-10在MEF來源的MSC誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性DC生成過程中的詳細(xì)作用機(jī)制。 [研究方法]1.磁珠分選純化Sca-1+CD117-Lin-MEF-MSC,分析其生物學(xué)特性,利用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)其免疫抑制性；2.體內(nèi)注射Sca-1+CD117-Lin-MEF-MSC,觀察其對(duì)機(jī)體炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié),以及流式檢測(cè)體內(nèi)DC的變化情況；3.體外共培養(yǎng)Sca-1+CD117-Lin-MEF-MSC和HPC,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)型DC的生成,基因芯片分析誘導(dǎo)生成的DC與傳統(tǒng)DC的差異,ELISA及中和抗體實(shí)驗(yàn)尋找共培養(yǎng)體系中發(fā)揮關(guān)鍵誘導(dǎo)作用的細(xì)胞因子,siRNA十?dāng)_技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)型DC分化過程中的作用,染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因在調(diào)節(jié)型DC生成過程中的組蛋白修飾狀態(tài)。 [研究結(jié)果]1.MEF來源的Sca-1+CD117-Lin-細(xì)胞具有典型的間充質(zhì)干細(xì)胞特性：梭形形態(tài)、“S”型生長(zhǎng)曲線、大多數(shù)細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0/G1期、高表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志分子和多能性基因、具有成脂成骨分化的能力；2.MEF-MSC具有低免疫原性,且能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能。體外能夠抑制異質(zhì)物引起的淋巴細(xì)胞增殖,在體內(nèi)能夠有效地緩解遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayed type hypersensitivity, DTH),減輕患處腫脹程度,上調(diào)外周血中IL-10的水平,增加外周血及脾臟中調(diào)節(jié)型DC的比例;3.MEF-MSC在體外不添加任何外源因子的情況下能夠誘導(dǎo)HPC生成CD11bhighIalowCD11clow調(diào)節(jié)型DC(稱之為sDC)。此sDC不同于傳統(tǒng)的imDC和maDC,且在體內(nèi)外具有較強(qiáng)的免疫抑制作用；4.MEF-MSC來源的IL-10對(duì)sDC的生成有重要作用,中和IL-10會(huì)減少CD11bhighIaloWCD11clow sDCs的生成；5.IL-10激活的細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3(Suppressor of cytokine signal3, SOCS3)的表達(dá)對(duì)sDC的生成必不可少。IL-10可能是通過兩種途徑影響SOCS3的表達(dá)：(1)激活JAK-STAT5信號(hào)通路；(2)改變關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOCS3基因的組蛋白修飾狀態(tài),影響其轉(zhuǎn)錄活性；6.嚴(yán)重創(chuàng)傷-失血合并閉合性骨折后的小鼠脾臟中成熟DC減少,而CD11bhighIalowCD11clowDC比例上升,這可能與損傷后機(jī)體自身的MSC免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。 [結(jié)論]MEF來源的Sca-1+CD117-Lin-MSC能夠通過分泌IL-10而激活HPC中SOCS3的表達(dá),從而誘導(dǎo)HPC分化生成CD11bhighIalowCD11clow調(diào)節(jié)型sDC。此實(shí)驗(yàn)闡明了MSC誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性DC分化的具體機(jī)制,為MSC應(yīng)用于臨床治療免疫性疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2346942