【摘要】：【研究背景】抗體分子可變區(qū)上的VH-VL抗原決定簇的總和稱為獨(dú)特型（idiotypic，，Id），獨(dú)特型上的表位被稱為獨(dú)特位(idiotope，Id)，它可以刺激機(jī)體在自身體內(nèi)或者異體內(nèi)誘導(dǎo)相應(yīng)的抗體，被稱為抗獨(dú)特型抗體(anti—idiotypeantibody，Anti-Id)。 Id和Anti-Id是構(gòu)成免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主要組成部分,其中由第一抗體Ab1的獨(dú)特型誘導(dǎo)產(chǎn)生的第二抗體Ab2β型抗獨(dú)特型抗體，可以作為原始抗原的分子模擬物，也稱抗原的內(nèi)映象(internal image)。研究人員根據(jù)Anti-Id的這種特點(diǎn)，通過抗獨(dú)特型抗體可以獲得具有催化作用的抗體，也稱抗體酶。 納米抗體是近年來發(fā)現(xiàn)的存在于駱駝重鏈抗體可變區(qū)、迄今為止最小的具有功能的抗體片段。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)可以利用駱駝納米抗體優(yōu)先識別酶活性中心的特性，高效獲得具有蒜氨酸酶催化活性的抗獨(dú)特型納米抗體。 這種結(jié)構(gòu)簡單的抗體，為研究其催化機(jī)制提供了便利條件。同時，在前期研究中利用溶菌酶從VHH抗體庫中篩選獲得了具有酶抑制活性的Ab1抗體，令人感興趣的是其中一個納米抗體NBL42，僅具有一個CDR3區(qū)，但卻保留了較強(qiáng)的溶菌酶抑制活性。值得進(jìn)一步研究。 【研究目的】為了更好的驗(yàn)證前期研究中提出的基于納米抗體的抗體酶制備策略，也為了今后進(jìn)一步闡明抗體酶模擬天然酶的機(jī)制，本研究以溶菌酶抑制性納米抗體NBL42為抗原，對已經(jīng)構(gòu)建好的新疆雙峰駝免疫噬菌體展示文庫進(jìn)行親和淘洗篩選，期望獲得具有溶菌酶活性的抗溶菌酶獨(dú)特型抗體，為抗體酶的研究和納米抗體的分子模擬機(jī)制研究提供線索。 【研究方法】通過輔助噬菌體滴度的測定，確定抗體庫噬菌體滴度。BLAST和DNAMAN軟件分析溶菌酶抑制性單域抗體NBL42、NBL114的氨基酸序列。對包含NBL42、NBL114的大腸桿菌宿主菌BL21經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)NBL42、NBL114。采用Ni-Sepharose4B親和層析純化帶His標(biāo)簽的抗體蛋白。SDS-PAGE鑒定純度，對NBL42、NBL114抗原溶菌酶結(jié)合能力采用ELISA進(jìn)行測定。 分別應(yīng)用NBL42和NBL114作為抗原,對本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的VHH抗體免疫文庫中進(jìn)行篩選,利用IgG3VHH序列上下游特異引物進(jìn)行菌落PCR鑒定VHH陽性克隆。引物序列如下VHH-P1:5′-CGCGGATCCGTCCTGGCTGCTCTTCTAC-3′,下游引物VHH-P2:5′-CCGCTCGAGCTTGCATACTTCATTCGTTTC-3′和帶有c-Myc標(biāo)簽的引物VHH-P3-IgG3-M:5’-CCGCTCGAGATTCAAGTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCTGAGGAGAC-3'。 陽性克隆經(jīng)測序證實(shí)為VHH抗體后，亞克隆到pET30a構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)純化。SDS-PAGE和Western blot檢測純化的抗體的純度。ELISA檢測與NBL42的特異結(jié)合。溶菌酶活性測定采用大腸桿菌進(jìn)行抑菌檢測吸光值的降低。酶活力單位定義為特定條件下，每分鐘使吸光度值OD_(450)降低0.001為1個酶活力單位�！狙芯拷Y(jié)果】經(jīng)測定，輔助噬菌體M13K07滴度為1.24×10~(13)pfu/mL，新疆雙峰駝免疫文庫噬菌體經(jīng)一輪擴(kuò)增后滴度為1.46×10~(13)pfu/mL。成功表達(dá)純化得到溶菌酶抑制性抗體NBL42、NBL114。 采用這兩種抗體對免疫文庫中進(jìn)行篩選，得到35個IgG3陽性克隆，根據(jù)菌落PCR結(jié)果選取20個克隆對其DNA序列進(jìn)行測定，其中5個具有VHH插入片段的克隆，通過NCBI和DNMAN分析測序結(jié)果，選擇了NBL(1-6)和NBL(2-3)兩個克隆用于進(jìn)行表達(dá)和純化。 首先從包含NBL(1-6)和NBL(2-3)兩個克隆的重組pCANTAB5E質(zhì)粒為模板，采用正向引物VHH-P1,反向引物VHH-P3-IgG3-M，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并連接到pET30a上，構(gòu)建原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)純化得到了帶有c-Myc標(biāo)簽的NBL(1-6)、NBL(2-3)兩個抗體， ELISA和Western blotting分析表明，NBL(1-6)、NBL(2-3)具有較好的抗原結(jié)合能力。 枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌檢測NBL(1-6)和NBL(2-3)的抑菌作用，結(jié)果顯示NBL(1-6)、NBL(2-3)對大腸桿菌具有一定抑制作用，OD_(450)值分別0.864±0.03和0.889±0.03（重復(fù)測定3次），陽性對照溶菌酶對大腸桿菌作用的OD_(450)值為0.855，PBS陰性對照OD_(450)值為1.065。根據(jù)酶活力計算公式測出NBL(1-6)酶活為7000U、NBL(2-3)酶活為4200U。 【研究結(jié)論】采用具有溶菌酶抑制活性的Ab1抗體NBL42，可以從VHH抗體免疫文庫中篩選獲得抗溶菌酶獨(dú)特型抗體；其中兩個抗體NBL(1-6)、NBL(2-3)能與Ab1抗體NBL42特異結(jié)合；篩選獲得的抗溶菌酶獨(dú)特型抗體NBL(1-6)、NBL(2-3)對大腸桿菌具有一定抑制作用，可能具有溶菌酶的催化活性。
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【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 陳艷;江明鋒;葉煜輝;劉勇濤;李生偉;;溶菌酶的研究進(jìn)展[J];生物學(xué)雜志;2009年02期

3 劉秉慈;;免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;1988年02期

本文編號：2333475