【摘要】：研究背景 氧化應(yīng)激(Oxidative Stress)是指機體在內(nèi)外環(huán)境有害刺激的條件下,體內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)和活性氮自由基(Reactive Nitrogen Species, RNS)所引起生理和病理反應(yīng)。由于它們可直接或間接氧化或損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA,從而誘發(fā)蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化和基因突變,氧化應(yīng)激是一把“雙刃劍”：一方面氧化應(yīng)激是機體一種最基本的保護(hù)機制,通過調(diào)節(jié)體內(nèi)多種信號通路,調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子,參與體內(nèi)炎癥、免疫、細(xì)胞增殖、細(xì)胞再生、修復(fù)等過程；另一方面超出體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)清除能力的氧化應(yīng)激,可導(dǎo)致ROS的大量積蓄,引起細(xì)胞和組織的損傷,并參與心血管疾病、器官纖維化、創(chuàng)傷愈合延遲、糖尿病、神經(jīng)退行性變及衰老和腫瘤的發(fā)生進(jìn)程。 已知蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)與氧化應(yīng)激下細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān),而作為蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)的重要伴侶分子Hsp90對維持氧化應(yīng)激下細(xì)胞的正常功能和存活至關(guān)重要。氧化應(yīng)激所致細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)下,Hsp90是否參與細(xì)胞周期蛋白cyclin B1變化的調(diào)節(jié),兩者之間是如何相互作用的?上述機理的闡述將為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的機制研究、疾病治療、疾病預(yù)防和新藥開發(fā)提供幫助。 目的 1.確定氧化應(yīng)激處理對HepG2細(xì)胞周期存在影響； 2.研究氧化應(yīng)激條件下,HepG2細(xì)胞內(nèi)Hsp90a和Cyclin B1的表達(dá)情況,兩者的共定位情況以及兩者的相互作用情況； 3.通過慢病毒介導(dǎo)的GFP-Hsp90αE47A基因在HepG2細(xì)胞內(nèi)表達(dá),從而競爭性抑制細(xì)胞內(nèi)總Hsp90α的ATPase活性； 4.在上一步的基礎(chǔ)上分析Hsp90對Cyclin B1的調(diào)節(jié)作用及對細(xì)胞周期阻滯的影響,并以此進(jìn)一步探討在氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞周期阻滯的分子機制及Hsp90α參與調(diào)節(jié)的作用機制。 方法 1.氧化應(yīng)激HepG2細(xì)胞分組：將細(xì)胞分為對照組、氧化應(yīng)激2h組、4h組、6h組、8h組、12h組、24h組。氧化應(yīng)激因素：500μmol/L H2O2,分別刺激相應(yīng)的時間； 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化； 3.免疫印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)羰基化蛋白、Hsp900α、Cyclin B1、泛素化蛋白、泛素化Cyclin B1蛋白的變化； 4.熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染Hsp90αE47A/psin-GFP基因的在HepG2細(xì)胞表達(dá)情況； 5.熒光定量PCR檢測氧化應(yīng)激后HepG2及Hsp90αE47A突變株Cyclin B1 mRNA變化情況； 6.免疫熒光檢測Hsp90α和Cyclin B1細(xì)胞內(nèi)共定位情況,免疫共沉淀法檢測Hsp90與Cyclin B1相互作用情況。 結(jié)果 1.H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)羰基化蛋白表達(dá)量明顯增多； 2.細(xì)胞氧化應(yīng)激24小時后,出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯； 3.氧化應(yīng)激導(dǎo)致胞內(nèi)Hsp90α蛋白表達(dá)量增加,6h,8h組出現(xiàn)高峰,12h-24h水平下降漸至正常；隨氧化應(yīng)激時間延長,Cyclin B1蛋白表達(dá)總量增加,磷酸化CyclinB1蛋白表達(dá)量先增加再降低； 4.轉(zhuǎn)染Hsp90aE47A/psin-GFP基因的細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光；免疫印跡結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Hsp90αE47A基因的細(xì)胞,與未轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞比較,有明顯外源性GFP-Hsp90aE47A蛋白的表達(dá)； 5.氧化應(yīng)激后HepG2及Hsp90a E47A突變株Cyclin B1 mRNA表達(dá)量未增加；Hsp90αE47A突變株細(xì)胞在無氧化應(yīng)激處理和6h氧化應(yīng)激條件下Cyclin B1蛋白水平較HepG2細(xì)胞對照組增加；流式檢測HepG2及Hsp90αE47A突變株細(xì)胞周期結(jié)果：氧化應(yīng)激24小時后HepG2及Hsp90αE47A突變株H202處理6小時組和未處理組均出現(xiàn)G2/M期阻滯； 6.免疫熒光與免疫共沉淀結(jié)果提示,隨著刺激時間的延長,Hsp90與CyclinB1相互作用增強,24h時處理組比對照組明顯增多； 7.免疫共沉淀結(jié)合免疫印記法檢測細(xì)胞泛素化Cyclin B1蛋白水平變化結(jié)果：隨著氧化應(yīng)激時間增加,泛素化Cyclin B1水平增加。 結(jié)論 1.H202作用于HepG2細(xì)胞不同時間,對細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷增強,在24h出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯。 2.氧化應(yīng)激可影響細(xì)胞內(nèi)Hsp90a和Cyclin B1的表達(dá)并改變其細(xì)胞內(nèi)分布與兩者的相互作用。 3.不同的氧化應(yīng)激水平和Hsp90α分子伴侶功能的變化共同影響對Cyclin B1的泛素化蛋白酶體降解通路,并對Cyclin B1的蓄積起著決定性作用,從而導(dǎo)致G2/M期阻滯。 4.通過慢病毒轉(zhuǎn)染使GFP-Hsp90aE47A基因在HepG2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),為后續(xù)實驗建立了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Study Background The oxidative stress refers to the physiological and pathological changes of reactive oxygen radical (ROS) and reactive nitrogen radical (RNS) in the body under the condition that the body is harmful to the internal and external environment. Because of their direct or indirect oxidation or damage to proteins, lipid and DNA, to induce protein denaturation, lipid peroxidation and gene mutation, oxidative stress is a 鈥渄ouble-edged sword鈥，

本文編號：2332960