【摘要】：癌癥嚴(yán)重危害人類健康,攻克癌癥一直受到醫(yī)療界的關(guān)注；因此多種治療藥物及其方法孕育而生,其中基因治療成為21世紀(jì)研究熱點(diǎn)�；蛑委熓峭ㄟ^插入治療基因至病變細(xì)胞內(nèi)而產(chǎn)生特定功能的蛋白質(zhì)或抑制異常基因表達(dá),從而治療疾病的一種新手段。安全、高效的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的研發(fā)成為關(guān)鍵。其癌細(xì)胞靶向性的研究又成為關(guān)鍵中的關(guān)鍵。目前基因載體分為兩類：病毒載體和非病毒載體。非病毒載體因具有制備簡單、低免疫原性且攜帶大分子量DNA及生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞。 在非病毒載體的制備過程中,陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI,Polyethyenimine)因其有較高的轉(zhuǎn)染率而被看作非病毒載體的黃金標(biāo)準(zhǔn)。PEI有線型或分枝狀結(jié)構(gòu),有較高的陽性電荷,與帶有陰性電荷的DNA或RNA結(jié)合能力較強(qiáng),所形成的復(fù)合物可通過靜置吸附等作用進(jìn)入細(xì)胞。PEI通過著名的質(zhì)子海綿效應(yīng),使溶酶體破裂從而將內(nèi)吞的DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核中并表達(dá)。PEI的分子量的范圍很廣,5000-25000 Da是目前作為基因轉(zhuǎn)染載體常用的一個范圍。一般說PEI的基因轉(zhuǎn)染效率隨著其分子量的增高而增大,但其毒性也隨之增大。如分枝狀PEI-25 KDa的轉(zhuǎn)染效率和毒性遠(yuǎn)比10 KDa的大,反之亦然。同時有報道PEI作為基因轉(zhuǎn)染載體直接體內(nèi)應(yīng)用會導(dǎo)致紅細(xì)胞的聚集,并與血液中的白蛋白等非特異性結(jié)合,影響轉(zhuǎn)染效率。 為了降低PEI毒性,提高其轉(zhuǎn)染率,通常的方法是改性PEI。改性后的PEI能提高PEI和DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性。通常聚乙二醇、環(huán)糊精和殼聚糖等高分子生物降解材料運(yùn)用到PEI的結(jié)構(gòu)修飾中,形成一種新的結(jié)構(gòu)。比如共聚物和聚輪烷等,并通過鏈接配體,利用某配體與癌細(xì)胞表面高表達(dá)某受體的專屬性特異結(jié)合的特點(diǎn)來提高靶向性,提高治療的作用。 研究目的： 本研究選用三種不同分子量的PEI(0.6 KDa,10 KDa和25 KDa,均為支鏈)接枝到以葉酸為封端劑而制備成的多聚輪烷(PR)上,形成具有葉酸受體靶向的聚乙烯亞胺—聚輪烷超分子衍生物(FPP),探討不同分子量PEI接枝后FPP性能和毒性的變化規(guī)律,并且研究FPP的DNA壓縮性、緩沖性、抗核酸酶降解性以及轉(zhuǎn)染性。從體內(nèi)外評價FPP的傳遞性能,為臨床提供安全高效的給藥系統(tǒng)。研究方法和內(nèi)容：分三大部分 第一部分以葉酸為封端劑的聚輪烷-聚乙酰亞胺超分子衍生物的合成、表征和性能測試 1、聚合物的合成：a、準(zhǔn)聚輪烷(pseudo-PR)的制備；b、葉酸活性酯(FA-NHS)的制備；c、多聚輪烷(PR)的制備；d、FPP的制備。2、聚合物表征：先后使用NMR、IR和UV等對聚合物進(jìn)行表征；通過1H-NMR中FPP不同組分的積分高比,求出a-環(huán)糊精(a-CD)上PEI的接枝率,FPP的平均分子量(Mw)。3、采用酸堿滴定法結(jié)合公式β=dC(HCl)/dpH計算聚合物的緩沖容量。4、瓊脂糖凝膠電泳法考察不同分子量FPP, BPP和PEI-25 KDa與DNA的結(jié)合能力,及其對DNA在核酸酶I作用下的保護(hù)作用,掃描電鏡觀察復(fù)合物的形態(tài)。5、復(fù)合物的毒性研究：a、不同濃度的FPPs (0.6 KDa、10 KDa、25 KDa)、BPP、PEI-25 KDa載體與DNA形成的復(fù)合物對Hela細(xì)胞和16 HBE細(xì)胞的影響；b、FPPs (0.6 KDa, 10 KDa、25 KDa)、BPP (BOC-Tyr-Osu為封端劑的聚輪烷-聚乙烯亞胺)、PEI-25 KDa載體與pLuc在不同N/P比的情況下形成的復(fù)合物對Hela細(xì)胞和16 HBE細(xì)胞的影響。 第二部分FPP物理、生物性能的研究 1、采用堿裂解法,通過制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、pAAV-EGFP和pLuc分別轉(zhuǎn)入和重組增殖、堿裂解法純化質(zhì)粒等工序,提取質(zhì)粒DNA；經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定大小及純度。2、采用激光粒度儀測定不同分子量FPP, BPP和PEI-25 KDa分別與DNA所形成的復(fù)合物的粒徑、Zeta電位。 第三部分體內(nèi)外復(fù)合物生物性能的研究 1、體外轉(zhuǎn)染率的研究：a:Luciferace評估FPPs (0.6 KDa、10 KDa、25 KDa)、BPP、PEI-25KDa載體與pLuc在不同N/P比的情況下形成的復(fù)合物對KB細(xì)胞的轉(zhuǎn)染影響；b:Luciferece評估FPP(0.6 KDa)、BPP、PEI-25 KDa與pLuc(N/P=20)形成的復(fù)合物在無血清、有1%胎牛血清(FBS)和0.1%蛋白質(zhì)的條件下對KB細(xì)胞的轉(zhuǎn)染影響；c：流式細(xì)胞儀評估FPP(0.6 KDa)、BPP、PEI-25 KDa與pAAV-EGFP (N/P=20)形成的復(fù)合物對KB細(xì)胞和A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)染影響；d：流式細(xì)胞儀評估FPPs (0.6 KDa、10 KDa、25 KDa)、BPP、PEI-25 KDa載體與pAAV-EGFP(N/P=20)形成的復(fù)合物分別對HEK 293T、KB、LoVo、A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染影響。 2、體內(nèi)轉(zhuǎn)染率的研究： a、動物模型的制備；b、通過瘤內(nèi)注射復(fù)合物的方式,分別在24小時和48小時,luciferace檢測PBS控制組,裸DNA (pLuc)組,PEI-25 KDa/pLuc,BPP/pLuc, FPP(0.6KDa)/pLuc, Lipotanmine/pLuc組的轉(zhuǎn)染率。c、尾靜脈注射,通過Caspase-9和Bax蛋白表達(dá)及瘤重大小的比較來檢測聚合物／p53復(fù)合物的抗瘤作用。d、通過裸DNA (p53), PEI/DNA (P53), BPP/DNA(p53)和FPP(0.6KDa)/DNA(p53)組小鼠肝臟、脾臟的HE染色病理片的比較,觀察載體在體內(nèi)毒性的大小。 結(jié)果： 第一部分以葉酸為封端劑的聚輪烷-聚乙酰亞胺超分子衍生物的合成、表征 1、NMR測定：a、pseudo-PR固體核磁顯示：pseudo-PR中a-CD上的C1、C4的單峰消失,取而代之的是寬峰的出現(xiàn)。b、PR'H-NMR的顯示：在6.6ppm、7.5ppm和8.5ppm處出現(xiàn)FA質(zhì)子峰；同時,在3-4ppm之間出現(xiàn)a-CD上C2、C4、C3、C5、C6相連的寬峰；3.6ppm的PEG上的CH2峰,結(jié)果表明FA封端成功。c、FPP'H-NMR的顯示：在6.7ppm、7.7ppm和8.7ppm處出現(xiàn)FA質(zhì)子峰；同時,在3-4ppm之間出現(xiàn)a-CD上C2、C4、C3、C5、C6相連的寬峰；3.6ppm的PEG上的CH2峰,另外,在2-3ppm之間出現(xiàn)PEI中-(CH2-CH2-NH)-峰,表明FPP制備成功。2、IR的測定：PR在1650 cm-1顯示有酰胺鍵形成,1605cm-1處顯示有苯環(huán)結(jié)構(gòu),701.4 cm-1(苯環(huán)上的C-H),苯環(huán)特征的出現(xiàn),意味著葉酸的鏈接成功。FPP：由于PEI氨基與a-CD中06H反應(yīng)形成酯鍵,因此在1705 cm-1,1031.42 cm-1,有一個較強(qiáng)的吸收。3、UV的測定：與FA相比,FPP上FA的紫外吸收由原來的250nm、280nm紅移到255nm和289nm。 接枝率的測定：FPP上0.6KDa,10KDa和25 KDa的接枝率分別為86.67%,36.66%和15.33%。 FPP(0.6K), FPP(10K), FPP(25K)平均分子量(Mn):85920 Da,453520Da,473520Da FPPs上各組分比值PEG:a-CD:PEI(0.6K,10K,25K)=1:20:(102,43.9,18.40)。 2、不同分子量的FPP,緩沖容量隨著分子量的增加而增大。 3、凝膠阻滯實(shí)驗顯示,FPP(0.6 KDa,10 KDa和25 KDa)在N/P比2-4之間,有較好的阻滯作用,其結(jié)果稍差與PEI-25 KDa. 4、聚合物對Hela、16 HBE細(xì)胞的相對生長率影響的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與PEI-25K相比,FPP (0.6 KDa,10 KDa和25 KDa)毒性顯著性降低,FPP (0.6 KDa.10 KDa和25 KDa)、BPP的IC50 (half maximal (50%) inhibitory concentration (IC) of a substance)值分別為：(Hela:189ug/ml,178ug/ml,160ug/ml,196ug/ml; 16 HBE:193ug/ml,182ug/ml, 171ug/ml,192ug/ml。 第二部分FPP物理、生物性能的研究 1、采用堿裂解法制備及純化后的pAAV-EGFP和pLuc純度和大小合適,A260/A280 (pAAV-EGFP)=1.90±0.055; A260/A280 (PLuc=1.84±0.021;質(zhì)粒分子量為5.3kb pAAV-EGFP和4.7kb的pLuc; pAAV-EGFP和pLuc質(zhì)粒的濃度計算分別為278.83±1.11ug/ml和269.86±1.03ug/ml。 2、當(dāng)N/P比到達(dá)10時,不同分子量的FPP與DNA結(jié)合成復(fù)合物的粒徑小于140nm；當(dāng)N/P比升高到20時,zeta電位在20-30 Mv之間。 第三部分體內(nèi)外復(fù)合物生物性能的研究 1、體外轉(zhuǎn)染效率：首先確定N/P。當(dāng)N/P=20時,FPP (0.6 KDa,10 KDa和25 KDa)的轉(zhuǎn)染效率大于BPP和PEI-25K的幅度比它們在其他N/P比時的增長幅度更大。而后考察了其他轉(zhuǎn)染條件。最后得出復(fù)合物最佳的轉(zhuǎn)染條件：轉(zhuǎn)染效率每孔加入DNA2ug;與DNA形成復(fù)合物的時間為30min；復(fù)合物在細(xì)胞上作用的時間為4h；在有血清的條件下,轉(zhuǎn)染效率有顯著的升高(*p0.05(?)(?)*p0.05),FPP(0.6K)/DNA轉(zhuǎn)染效率分別是無血清的8.5倍和10倍；和Opti-MEM (blank)相比,10%-15%FBS和ALB(0.1-0.2%)轉(zhuǎn)染效率分別擴(kuò)大了2.5-3.5倍；在不同濃度FBS和ALD中的轉(zhuǎn)染率無明顯差異。 2、體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率： a、成功構(gòu)建小鼠腫瘤模型。 b、Liuciferase評估結(jié)果顯示在24h FPP(0.6K) (N/P=20)的轉(zhuǎn)染率與PEI-25 KDa (N/P=10) and BPP組相比分別高出6.1和5.6倍(*p0.05 and*p0.05),并且?guī)缀跏?36倍的裸DNA組的熒光量。 c、體內(nèi)抗瘤活性的評估：(a)、腫瘤重量：與BPP/p53、PEI-25 KDa/p53. naked p53、PBS groups相比,FPP(0.6K)/p53組瘤重明顯變小(*p0.05,*p0.05, **p0.05,**p0.05, respectively); (b)、caspase-9和bax表達(dá)：和正常對照組、PEI-25 KDa/p53 (N/P=10), BPP/p53組和FPP(0.6K) (N/P=20)/p53組相比,KB模型組中的caspase-9 and bax表達(dá)顯著降低(*p0.05,*p0.05, *p0.05, and*p0.05),其中FPP/p53組顯著性低于BPP/p53組(*p0.05,*p0.05)。 d、HE染色：FPP(0.6K), FPP(10K)、FPP(25K)和裸DNA四組之間的小鼠肝臟和脾臟未見有什么變化,表明FPP(0.6K), FPP(10K)、FPP(25K)載體毒性較小。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建新的非病毒載體(聚乙酰亞胺-聚輪烷,FPP)超分子聚合物；通過一系列的工藝研究得出了最佳的摩爾投料比,并且此工藝可控。 2、合成的FPPs聚合物具有以下物理學(xué)特點(diǎn)：較好的緩沖容量；較理想的粒徑、電位；較好的壓縮DAN性能。 3、合成的FPPs聚合物具有以下生理學(xué)特點(diǎn)：在體內(nèi)外實(shí)驗中,和PEI-25K相比,FPPs具有較低的毒性和較高的轉(zhuǎn)染率。 4、FPPs/DNA復(fù)合物在含有豐富葉酸受體的癌細(xì)胞上有較高的轉(zhuǎn)染率。 總之,FPPs系列載體具有高效的轉(zhuǎn)染性、較低的毒性和葉酸受體癌細(xì)胞靶向性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

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本文編號：2324140