【摘要】：目的： 人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)是人類最常見的先天性感染病毒,在人群中感染率很高,一旦感染后,常不能被機體完全清除,可長期甚至終身攜帶。目前針對HCMV還沒有安全有效的疫苗,而抗HCMV的藥物種類有限,目前包括更昔洛韋、西多福韋、膦甲酸、福米韋生、馬立巴韋等。但這些藥物都是針對病毒侵入靶細胞后的復(fù)制翻譯階段起作用,并且有多種毒副作用及耐藥性的產(chǎn)生。目前尚缺乏阻遏HCMV侵入靶細胞,即在HCMV與靶細胞膜黏附、結(jié)合或者融合等環(huán)節(jié)起作用的藥物研究。 甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)是一種由肝臟合成的c型凝集素。MBL通過結(jié)合病原微生物表面的甘露糖等糖基受體而直接介導(dǎo)調(diào)理吞噬作用和/或通過凝集素途徑激活補體,在機體的天然免疫防御中發(fā)揮重要作用。已有實驗室研究發(fā)現(xiàn),MBL對HIV、流感病毒、SARS冠狀病毒等都有阻滯作用。同時,臨床上也證明,MBL缺陷個體對HIV和HCMV的易感性增加,疾病進展過程加快,繼發(fā)隱孢子蟲病等二重感染率也顯著增加。但目前尚無將MBL用于防治HCMV感染的研究。 因此,本研究首先構(gòu)建MBL的真核表達載體,并在哺乳細胞CHO中穩(wěn)定持續(xù)表達,純化得到重組MBL (rMBL)。然后在體外建立HCMV感染的細胞模型,用不同濃度的rMBL或天然MBL (hMBL)通過不同途徑與之相互作用,然后用多種手段綜合評價感染情況的變化,從而探討MBL的抗HCMV作用途徑和機制,為HCMV的防治提供新的思路。 方法： 1. MBL-CDNA TA克隆的建立 將MBL序列(747bp) oligo化學(xué)合成,將合成好的序列克隆入pCR2.1-TOPO載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α,挑出陽性重組子菌落小量擴增,快速抽提質(zhì)粒測序驗證重組克隆,確定其包含MBL基因序列。至此得到MBL-CDNA TA克隆。 2.真核表達載體PIRES2-AcGFP-MBL的構(gòu)建 以上述來自MBL-CDNA克隆的質(zhì)粒為模板,進行PCR擴增。擴增引物經(jīng)設(shè)計帶有Xhol和EcoRI限制酶切位點。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后和目的載體PIRES2-AcGFP分別用Xhol和EcoRI雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a,擴增提取質(zhì)粒后經(jīng)雙向測序鑒定為目的基因。將構(gòu)建成功的表達質(zhì)粒以及空載體質(zhì)粒分別搖菌擴增,轉(zhuǎn)染級抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,用紫外分光光度計對質(zhì)粒濃度進行檢測。 3.CHO細胞的轉(zhuǎn)染和篩選 轉(zhuǎn)染：用lipofectamine 2000試劑盒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建成功的真核表達載體PIRES2-AcGFP-MBL轉(zhuǎn)入CHO-K1細胞,通過觀察熒光表達評價轉(zhuǎn)染情況。 加藥篩選：預(yù)先測定CHO細胞對G418的死亡曲線,確定穩(wěn)轉(zhuǎn)篩選使用G418濃度。將轉(zhuǎn)染后48小時的CHO進行持續(xù)加藥篩選,每天觀察細胞狀況以及熒光情況,最后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。 4. RT-PCR分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株MBL基因的表達 收集穩(wěn)轉(zhuǎn)PIRES2-AcGFP-MBL的細胞(CHO-MBL)和空載體的CHO細胞,提取細胞總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到細胞的CDNA,然后行realtime-PCR擴增MBL基因,比較兩種細胞內(nèi)基因的表達量。 5.親和層析法分離純化MBL 將CHO-MBL細胞培養(yǎng)上清先進行離心超濾濃縮,然后進行預(yù)處理。將預(yù)處理后的樣品通過甘露聚糖-Sepharose 4B層析柱進行分離純化,純化得到的目的蛋白進行去離子透析后近一步離心超濾濃縮,然后行SDS-PAGE蛋白電泳,考馬斯亮藍染色測定蛋白純度。天然MBL來自人血漿,純化步驟同上。 6.ELISA法測定重組蛋白濃度 采用human mbl ELISA kit,在酶聯(lián)板中分別加入倍比稀釋的rMBL/hMBL樣品和不同濃度的標準品,復(fù)孔加樣。按試劑盒說明反應(yīng)完成后將酶標板置于自動酶聯(lián)儀上測定D450nm值,根據(jù)標準曲線計算各樣本的MBL濃度。 7.研究MBL阻滯HCMV入侵細胞的功能 HCMV用不同濃度的rMBL/hMBL或加甘露聚糖孵育HCMV,將孵育后的HCMV感染MRC-5細胞2小時,充分洗去未入侵的HCMV,收集細胞,分別用q-PCR和流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)的HCMV-DNA拷貝數(shù)和HCMV-PP65陽性率。一部分實驗中,將HCMV用PKH-26染色后,再以rMBL/hMBL孵育,然后感染MRC-5細胞,感染后將細胞固定,加入波形蛋白抗體作免疫熒光染色,然后激光共聚焦顯微鏡下觀察感染情況。 8.研究MBL阻滯HCMV在細胞間擴散的功能 HCMV感染后的MRC-5細胞用不同濃度的rMBL/hMBL或加甘露聚糖共培養(yǎng)3天,每24小時取上清q-PCR檢測HCMV-DNA拷貝濃度,第72小時光鏡下觀察細胞病變效應(yīng),然后收集細胞,分別用q-PCR和流式細胞術(shù)檢測細胞內(nèi)的HCMV-DNA拷貝數(shù)和HCMV-PP65陽性率。 結(jié)果： 1.MBL序列經(jīng)化學(xué)合成后分別克隆入pCR2.1-TOPO載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5a后,快速抽提質(zhì)粒分別測序驗證重組克隆,測序結(jié)果與MBL基因序列完全一致,表明MBL-CDNA TA克隆建立成功。 2.從已建立MBL-CDNA克隆中提取質(zhì)粒,通過PCR引入酶切位點,和目的載體PIRES2-AcGFP同樣經(jīng)雙酶切后連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,擴增提取質(zhì)粒后酶切得到5.3kb(載體),774bp(目的基因)2個片斷,目的基因片斷經(jīng)雙向測序鑒定包含MBL基因。 3.構(gòu)建成功的表達載體和空載體同時轉(zhuǎn)染CHO細胞,然后按照測定的CHO細胞對G418的死亡曲線,以400μg/ml的G418濃度進行持續(xù)加壓篩選,3周后,獲得2株分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體和PIRES2-AcGFP-MBL的細胞株,后者命名為CHO-MBL。 4.從2種細胞株分別取細胞抽提RNA后進行逆轉(zhuǎn)錄,得到CDNA,然后行real-time PCR定量MBL基因的表達,CHO-MBL目的基因表達是轉(zhuǎn)染空載體細胞株的103倍以上。 5. CHO-MBL的上清2000ml超濾濃縮成200ml,行親和層析,收集含蛋白吸脫液約15ml,經(jīng)PBS透析3天后,再超濾濃縮,得到rMBL1.5ml.然后ELISA檢測到1.5ml樣品中活性MBL蛋白質(zhì)濃度為800μg/ml,即原始培養(yǎng)上清中活性rMBL濃度為600μg/L. rMBL進行SDS-PAGE還原電泳,可見32KD單體,非還原電泳均為170KD之多聚體。 6.用梯度濃度的rMBL/hMBL或加甘露聚糖孵育的HCMV感染MRC-5細胞2小時,結(jié)果q-PCR檢測經(jīng)10μg/ml rMBL/hMBL孵育的HCMV,侵入細胞的量顯著低于未經(jīng)處理的HCMV,而1μg/ml和5μg/ml rMBL/hMBL孵育的HCMV,侵入細胞的量雖低于未經(jīng)處理的HCMV,但未達到統(tǒng)計學(xué)意義。而經(jīng)過10μg/ml的rMBL/hMBL和20mg/ml的甘露聚糖同時孵育的HCMV,侵入細胞的量和對照組相比也無顯著性差異。同時發(fā)現(xiàn),10μg/ml的hMBL處理組的HCMV感染率明顯低于10μg/ml的rMBL處理組的HCMV感染率。激光共聚焦顯示感染2小時后病毒顆粒基本位于胞質(zhì)內(nèi),并進一步證實,經(jīng)10μg/ml的rMBL/hMBL孵育后的病毒,進入細胞的數(shù)量明顯減少。 7. HCMV感染MRC-5細胞后,再和MBL共培養(yǎng),結(jié)果經(jīng)q-PCR檢測,經(jīng)10μg/ml的rMBL/hMBL孵育的HCMV,在培養(yǎng)第24小時和第48小時,各實驗組培養(yǎng)上清內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)低于對照組,但未達到統(tǒng)計學(xué)強度。而在培養(yǎng)第72小時細胞內(nèi)的量和培養(yǎng)上清中的量均顯著低于未經(jīng)處理的HCMV,而1μg/ml和5μg/ml的rMBL/hMBL孵育的HCMV和未經(jīng)處理的HCMV相比,結(jié)果無顯著性差異。同時比較細胞內(nèi)PP65陽性率以及細胞病變效應(yīng),10μg/ml的rMBL/hMBL孵育組也低于對照組。 結(jié)論： 1.獲得了表達人MBL的CHO細胞株和有較強生物活性的rMBL。 2. rMBL在CHO細胞中的產(chǎn)量為600μg/L,多為170KD的多聚體,有較強生物活性。 3.MBL在細胞外液中的濃度達到10μg/ml時候能阻滯HCMV入侵細胞,作用達到一定時間后能夠阻滯已入侵HCMV在細胞間傳播和增殖。 4.MBL可能通過糖結(jié)合區(qū)和病毒的糖蛋白結(jié)合,阻遏病毒吸附入侵細胞而起抗病毒作用。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R373

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 余鐘聲;鄭季彥;陳黎勤;尚世強;吳家波;;嬰兒人巨細胞病毒感染病原學(xué)和臨床分析[J];中華傳染病雜志;2006年05期

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本文編號：2319757