【摘要】：p38亞家族蛋白激酶與ERK(extracellular signal-regulated kinase)和JNK(c-Jun NH2-terminal protein kinase),同屬M(fèi)APK(mitogen-activated protein kinase)超家族成員。p38的經(jīng)典活化模式為MAPK家族成員所共有,即MAP3K(MAPK kinase kinase)磷酸化MAP2K(MAPK kinase),MAP2K磷酸化MAPK的級聯(lián)酶促反應(yīng)。p38依靠活化環(huán)中Thr-Gly-Tyr模序上180位的蘇氨酸(Thr180)和182位酪氨酸(Tyr182)發(fā)生磷酸化而活化。MKK3和MKK6是p38經(jīng)典活化通路中兩個(gè)主要的上游MAP2K,UV等物理性刺激或者TNF-α等炎性因子刺激可以通過它們活化p38。除了經(jīng)典活化之外,p38還存在替代活化模式,通過不依賴上游激酶的分子內(nèi)自我磷酸化作用,使Thr180和Tyr182位點(diǎn)磷酸化而活化。 p38一直被認(rèn)為是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的中心分子。然而,大量的證據(jù)包括我們最近的研究表明,p38在細(xì)胞生與死的精確調(diào)控中也扮演重要角色。p38的兩種不同活化模式:級聯(lián)磷酸化或者自我磷酸化,都參與細(xì)胞死亡調(diào)控。近幾年我們小組的幾項(xiàng)研究揭示,通過經(jīng)典模式活化的p38能夠促進(jìn)核因子-κB (NF-κB)獲得充分的轉(zhuǎn)錄活性,從而在普通成纖維細(xì)胞或者成纖維瘤L929細(xì)胞中拮抗TNF-α誘導(dǎo)的死亡。而其他的一些研究表明,p38的一種替代活化方式,即與接頭蛋白TAB1[transforming growth factor-β(TGF-β)-activated protein kinase 1 (TAK1)-binding protein 1]相互作用后引起的自我磷酸化,介導(dǎo)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。盡管p38在細(xì)胞生死調(diào)節(jié)機(jī)制中的重要性已經(jīng)被證實(shí),然而,其中p38活化的詳細(xì)分子機(jī)制仍不清楚。接頭分子TAB1只能與p38家族的p38α發(fā)生相互作用,而不與p38的其它亞型作用,這種相互作用的特異性使之成為防治心肌缺血再灌注損傷的潛在靶位,所以,精確了解TAB1/p38α相互作用復(fù)合物的3-D結(jié)構(gòu)成為必須。另外,接頭蛋白早已被證實(shí)是ERK和JNK經(jīng)典模式活化所必不可少的,然而參與p38經(jīng)典模式活化的接頭蛋白還鮮有報(bào)道。我們小組前期工作證實(shí)GNB2L1,一個(gè)以Trp-Asp(WD)重復(fù)序列為特征并廣泛參與多條通路調(diào)節(jié)的的接頭蛋白,可直接結(jié)合MKK7,從而促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的JNK活化。GNB2L1能否調(diào)節(jié)TNF-α誘導(dǎo)的p38活化并由此來調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡就成為我們很關(guān)心的問題。 在本次研究中,借助同源模建、從頭搭建和分子對接等計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)技術(shù),與傳統(tǒng)分子生物學(xué)手段一起,我們找到了TAB1與p38α相互作用的關(guān)鍵氨基酸。在p38α中,Asp230和Tyr258是我們新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)p38α與TAB1結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸;先前報(bào)道過的Thr218也在模建預(yù)測的關(guān)鍵氨基酸中。相應(yīng)的,TAB1中的相對應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸為Ser399、Ser401、Asn436和Thr440,均為首次報(bào)道。關(guān)鍵氨基酸點(diǎn)突變后能夠減弱或者增強(qiáng)TAB1/p38α相互作用,均與分子模建預(yù)測相符;但有趣的是,突變后無論結(jié)合能力變強(qiáng)或是變?nèi)?TAB1介導(dǎo)的p38α的自我磷酸化都明顯降低;這提示p38α實(shí)現(xiàn)自我磷酸化對結(jié)構(gòu)具有高度依賴性,只有最適度的相互作用才能實(shí)現(xiàn)最佳的自我磷酸化�；谏鲜霭l(fā)現(xiàn),我們設(shè)計(jì)了能夠阻斷TAB1/p38α相互作用的拮抗肽PT1-PT6,并在細(xì)胞水平進(jìn)行體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)對拮抗肽的活性進(jìn)行評價(jià)。最終,我們選擇了效果最好的PT5,并合成帶有穿膜肽的D構(gòu)象PT5(防止體內(nèi)降解)來進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。多肽合成時(shí),HIV的TAT穿膜序列通過兩個(gè)D型脯氨酸(D-Pro)連接在D型PT5的羧基端。細(xì)胞內(nèi),D-PT5能夠阻斷TAB1/p38α相互作用并抑制TAB1介導(dǎo)的p38α自我磷酸化發(fā)生。進(jìn)一步,D-PT5在大鼠實(shí)驗(yàn)中,顯著降低了缺血再灌注后的心肌損傷。我們的工作為設(shè)計(jì)一個(gè)通過特異阻斷TAB1/p38α相互作用來治療心肌缺血再灌注損傷的藥物提供了理想的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。 在本文另一部分研究中,我們發(fā)現(xiàn)GNB2L1與MKK6在體內(nèi)和體外均能發(fā)生相互作用,發(fā)生結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域在GNB2L1的WD1結(jié)構(gòu)域。GNB2L1過表達(dá)能夠增強(qiáng)p38的磷酸化并促使L929細(xì)胞拮抗TNF-α誘導(dǎo)的死亡;而WD1結(jié)構(gòu)與缺失的GNB2L1則不能顯示出這種效應(yīng)。GNB敲低后,則顯示出與過表達(dá)相反的效應(yīng)。我們的工作發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的調(diào)節(jié)p38經(jīng)典模式活化的接頭蛋白。
[Abstract]:p38浜氬鏃忚泲鐧芥縺閰朵笌ERK(extracellular signal-regulated kinase)鍜孞NK(c-Jun NH2-terminal protein kinase),鍚屽睘MAPK(mitogen-activated protein kinase)瓚呭鏃忔垚鍛，

本文編號：2316782