【摘要】：HIV-1Tat蛋白是病毒產(chǎn)生的重要調(diào)控蛋白和致病因子，在HIV-1的復(fù)制、擴(kuò)散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)中合成的Tat可進(jìn)入細(xì)胞核反式激活HIV-1RNA的轉(zhuǎn)錄，從而激活HIV-1的增殖。此外，Tat還可被感染細(xì)胞分泌到胞外發(fā)揮多種細(xì)胞外功能在致病中起重要作用，如抑制免疫細(xì)胞的增值、分化、誘導(dǎo)其凋亡；促進(jìn)病毒播散；促進(jìn)卡波式肉瘤腫瘤細(xì)胞的生長；誘發(fā)神經(jīng)損傷等。鑒于其多種生物學(xué)活性，Tat被認(rèn)為是“病毒毒素”，是藥物干預(yù)和治療性疫苗的重要靶標(biāo)。 多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染者中代謝紊亂綜合癥的發(fā)生率顯著高于正常人群，如脂代謝異常、胰島素抵抗、心臟代謝紊亂、磷酸代謝異常和損傷的葡萄糖耐受等。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)多種危險(xiǎn)因素，但其病因仍然不清楚。而有多種生物學(xué)功能的HIV-1Tat蛋白在其中所起的作用值得研究和探討。 代謝組學(xué)是自上而下的系統(tǒng)生物學(xué)方法，它是對(duì)一個(gè)生物體系中所有小分子代謝物進(jìn)行定性定量分析的整體性方法，已廣泛應(yīng)用于疾病診斷及作用機(jī)理、藥物毒理學(xué)、藥效評(píng)價(jià)、基因功能及中藥質(zhì)量控制等領(lǐng)域。相對(duì)于轉(zhuǎn)錄組和蛋白組來說，其分析對(duì)象的理化性質(zhì)更加多樣，是一個(gè)非常復(fù)雜的分析體系。代謝物組中的化合物在性質(zhì)（從強(qiáng)極性到非極性）和濃度（從mM到pM）上的巨大差異對(duì)現(xiàn)有的分析技術(shù)是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。在當(dāng)前的技術(shù)條件下僅憑一種分析技術(shù)很難建立無偏的全局的代謝組學(xué)分析方法。因此為了獲得更加廣泛的代謝物信息，近年來多種互補(bǔ)的分析方法相結(jié)合廣泛應(yīng)用到代謝組學(xué)研究中，如質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR）結(jié)合；氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜結(jié)合（LC-MS）；親水相互作用色譜-質(zhì)譜（HILIC-MS）和反相液相色譜-質(zhì)譜（RPLC-MS）相結(jié)合等。本研究以GC MS、RPLC-MS和HILIC MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)多元方法為手段，以HIV-1Tat為研究對(duì)象，從整體動(dòng)物和細(xì)胞水平闡明代謝組學(xué)方法在HIV-1Tat致病機(jī)制中的應(yīng)用。主要內(nèi)容如下： 一、 HIV-1Tat在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及生物活性鑒定 在本課題組構(gòu)建的HIV-1HXB2株Tat質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，通過PCR方法合成HIV-1IIIB株BH10克隆Tat DNA序列，并構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒tat-pET21b，轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到的重組蛋白的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的約15%；重組表達(dá)的Tat蛋白經(jīng)Ni-NTA親和柱和SP-Sepharose離子交換柱純化，得到了純度約90%的Tat蛋白。經(jīng)Western鑒定在約15kD得到陽性的蛋白表達(dá)條帶。鱟試劑盒檢測(cè)內(nèi)毒素LPS的含量約為0.05EU/μg，滿足LPS限量要求。細(xì)胞模型上鑒定純化的Tat蛋白保留了生物學(xué)活性。 二、基于GC-MS技術(shù)的HIV-1Tat誘導(dǎo)的ICR小鼠的血清代謝組學(xué)研究 Tat蛋白由感染的細(xì)胞釋放，發(fā)揮多種生物學(xué)作用如破壞免疫系統(tǒng)、促進(jìn)病毒播散和致病性。目前Tat蛋白對(duì)代謝物的影響還未見報(bào)道。本課題以對(duì)照小鼠血清和HIV-1Tat處理的小鼠血清為分析對(duì)象，研究建立了內(nèi)源性代謝物譜的GC-MS分析方法，并利用NIST2002質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對(duì)檢測(cè)到的代謝物進(jìn)行快速鑒定。在綜合考察供試品制備方法、衍生化條件和色譜分析條件的基礎(chǔ)上，獲取了一個(gè)峰容量大、分離效果佳的GC-MS分析條件，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，所建立的GC-MS方法可較好地表征生物樣本的代謝物譜特征，分析結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于代謝組學(xué)研究。采用建立的GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)Tat誘導(dǎo)的小鼠血清中的代謝物，并用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法分析（PLS-DA）法對(duì)所獲得的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別。研究結(jié)果顯示，Tat可誘導(dǎo)小鼠血清16種代謝物顯著變化，它們涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝等多條代謝通路，為Tat致病機(jī)制的闡釋和艾滋病的治療提供了新的線索。 三、基于LC/GC-MS和定量PCR技術(shù)的HIV-1Tat誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞的代謝組學(xué)研究 HIV-1Tat蛋白由感染的細(xì)胞釋放，作用于鄰近未感染的T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)多種病理效應(yīng)。上一章我們已經(jīng)在小鼠模型上用基于GC-MS的代謝組學(xué)方法揭示了Tat可誘導(dǎo)體內(nèi)多種代謝物發(fā)生變化，為了深入研究其干擾機(jī)制，本章我們?cè)隗w外以HIV-1Tat處理的Jurkat T淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象，采用基于GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS相結(jié)合的代謝組學(xué)方法檢測(cè)Tat處理的Jurkat T淋巴細(xì)胞胞內(nèi)及胞外代謝物，并用PCA和PLS-DA對(duì)所獲得的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別。通過信息處理得到了37種差異代謝物，根據(jù)標(biāo)志物，我們構(gòu)建了Tat調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)示意圖，并采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法對(duì)代謝通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶進(jìn)行了測(cè)定，得到了7種顯著改變的調(diào)節(jié)酶且與代謝物變化相符，從酶的調(diào)控驗(yàn)證了Tat誘導(dǎo)的代謝變化。本研究結(jié)合上章的結(jié)果提示Tat可能是HIV相關(guān)的代謝綜合癥的重要致病因子。我們的研究結(jié)果為Tat藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和疫苗的設(shè)計(jì)提供科學(xué)依據(jù)。 四、我國HIV感染者中抗Tat抗體的反應(yīng)特點(diǎn)研究 在HIV-1感染者中，Tat抗體的出現(xiàn)與艾滋病的發(fā)病及病呈進(jìn)展的關(guān)系出現(xiàn)了兩種相反的結(jié)論。因此，全面深入的Tat抗體檢測(cè)有助于揭示Tat和HIV發(fā)病及病程的關(guān)系，對(duì)Tat的致病性研究及開發(fā)有效的Tat疫苗具有重要意義。為了鑒定Tat抗體反應(yīng)類型，我們測(cè)定了326份HIV感染者中抗Tat抗體反應(yīng)，，100份健康獻(xiàn)血員血漿作為陰性對(duì)照。我們首先用全長Tat作為檢測(cè)抗原從326份HIV陽性血漿樣本中篩選抗Tat抗體陽性樣本，進(jìn)一步用我們?cè)O(shè)計(jì)合成的6個(gè)Tat肽段作為分析抗原將抗體反應(yīng)進(jìn)行分類，并對(duì)每個(gè)樣本的Tat反式激活的中和能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，326份HIV陽性血漿樣本檢測(cè)出42份為抗Tat抗體陽性和6份Tat相關(guān)抗體，根據(jù)與不同分析抗原的反應(yīng)特點(diǎn)將其分為以下6種反應(yīng)類型：全陽性反應(yīng)、綜合的反應(yīng)、N-特異性反應(yīng)、C-特異性反應(yīng)、全長Tat反應(yīng)和Tat相關(guān)反應(yīng)。中和實(shí)驗(yàn)顯示Tat反式激活的中和能力與抗體反應(yīng)類型及CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著相關(guān)。我們的結(jié)果為更好地理解Tat在HIV致病中的重要作用和設(shè)計(jì)有效的Tat疫苗提供重要信息，也為進(jìn)一步用代謝組學(xué)方法研究Tat在HIV感染者體內(nèi)的生物活性奠定基礎(chǔ)。 本文是首次通過基于LC-MS和GC-MS相結(jié)合的代謝組學(xué)方法在整體動(dòng)物和細(xì)胞水平對(duì)Tat活性進(jìn)行系統(tǒng)的代謝組學(xué)研究，通過多變量數(shù)據(jù)分析得到了Tat活性相關(guān)的差異代謝物，涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂代謝和氨基酸代謝等多條代謝通路。這些發(fā)現(xiàn)有助于揭示Tat“病毒毒素”復(fù)雜的致病機(jī)制，提示Tat可能作為治療性干預(yù)的重要靶標(biāo)，阻斷或修飾這些異常的代謝通路對(duì)于治療由HIV感染引起的代謝紊亂綜合癥具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。此外，我們的結(jié)果表明基于整合的GC-MS和LC-MS的代謝組學(xué)方法在細(xì)胞代謝物組分析中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2309128