【摘要】：HIV-1Tat蛋白是病毒產(chǎn)生的重要調(diào)控蛋白和致病因子，在HIV-1的復制、擴散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶細胞后，細胞質(zhì)中合成的Tat可進入細胞核反式激活HIV-1RNA的轉(zhuǎn)錄，從而激活HIV-1的增殖。此外，Tat還可被感染細胞分泌到胞外發(fā)揮多種細胞外功能在致病中起重要作用，如抑制免疫細胞的增值、分化、誘導其凋亡；促進病毒播散；促進卡波式肉瘤腫瘤細胞的生長；誘發(fā)神經(jīng)損傷等。鑒于其多種生物學活性，Tat被認為是“病毒毒素”，是藥物干預和治療性疫苗的重要靶標。 多個研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染者中代謝紊亂綜合癥的發(fā)生率顯著高于正常人群，如脂代謝異常、胰島素抵抗、心臟代謝紊亂、磷酸代謝異常和損傷的葡萄糖耐受等。盡管已有研究發(fā)現(xiàn)多種危險因素，但其病因仍然不清楚。而有多種生物學功能的HIV-1Tat蛋白在其中所起的作用值得研究和探討。 代謝組學是自上而下的系統(tǒng)生物學方法，它是對一個生物體系中所有小分子代謝物進行定性定量分析的整體性方法，已廣泛應(yīng)用于疾病診斷及作用機理、藥物毒理學、藥效評價、基因功能及中藥質(zhì)量控制等領(lǐng)域。相對于轉(zhuǎn)錄組和蛋白組來說，其分析對象的理化性質(zhì)更加多樣，是一個非常復雜的分析體系。代謝物組中的化合物在性質(zhì)（從強極性到非極性）和濃度（從mM到pM）上的巨大差異對現(xiàn)有的分析技術(shù)是一個重大的挑戰(zhàn)。在當前的技術(shù)條件下僅憑一種分析技術(shù)很難建立無偏的全局的代謝組學分析方法。因此為了獲得更加廣泛的代謝物信息，近年來多種互補的分析方法相結(jié)合廣泛應(yīng)用到代謝組學研究中，如質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR）結(jié)合；氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）和液相色譜-質(zhì)譜結(jié)合（LC-MS）；親水相互作用色譜-質(zhì)譜（HILIC-MS）和反相液相色譜-質(zhì)譜（RPLC-MS）相結(jié)合等。本研究以GC MS、RPLC-MS和HILIC MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合化學計量學多元方法為手段，以HIV-1Tat為研究對象，從整體動物和細胞水平闡明代謝組學方法在HIV-1Tat致病機制中的應(yīng)用。主要內(nèi)容如下： 一、 HIV-1Tat在大腸桿菌中的表達、純化及生物活性鑒定 在本課題組構(gòu)建的HIV-1HXB2株Tat質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，通過PCR方法合成HIV-1IIIB株BH10克隆Tat DNA序列，并構(gòu)建其原核表達質(zhì)粒tat-pET21b，轉(zhuǎn)化到表達宿主菌BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導，得到的重組蛋白的表達量占細菌總蛋白的約15%；重組表達的Tat蛋白經(jīng)Ni-NTA親和柱和SP-Sepharose離子交換柱純化，得到了純度約90%的Tat蛋白。經(jīng)Western鑒定在約15kD得到陽性的蛋白表達條帶。鱟試劑盒檢測內(nèi)毒素LPS的含量約為0.05EU/μg，滿足LPS限量要求。細胞模型上鑒定純化的Tat蛋白保留了生物學活性。 二、基于GC-MS技術(shù)的HIV-1Tat誘導的ICR小鼠的血清代謝組學研究 Tat蛋白由感染的細胞釋放，發(fā)揮多種生物學作用如破壞免疫系統(tǒng)、促進病毒播散和致病性。目前Tat蛋白對代謝物的影響還未見報道。本課題以對照小鼠血清和HIV-1Tat處理的小鼠血清為分析對象，研究建立了內(nèi)源性代謝物譜的GC-MS分析方法，并利用NIST2002質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對檢測到的代謝物進行快速鑒定。在綜合考察供試品制備方法、衍生化條件和色譜分析條件的基礎(chǔ)上，獲取了一個峰容量大、分離效果佳的GC-MS分析條件，并對其進行了方法學驗證。研究結(jié)果表明，所建立的GC-MS方法可較好地表征生物樣本的代謝物譜特征，分析結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于代謝組學研究。采用建立的GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測Tat誘導的小鼠血清中的代謝物，并用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法分析（PLS-DA）法對所獲得的代謝組數(shù)據(jù)進行模式識別。研究結(jié)果顯示，Tat可誘導小鼠血清16種代謝物顯著變化，它們涉及氨基酸代謝、三羧酸循環(huán)、脂肪酸代謝等多條代謝通路，為Tat致病機制的闡釋和艾滋病的治療提供了新的線索。 三、基于LC/GC-MS和定量PCR技術(shù)的HIV-1Tat誘導Jurkat細胞的代謝組學研究 HIV-1Tat蛋白由感染的細胞釋放，作用于鄰近未感染的T淋巴細胞誘導多種病理效應(yīng)。上一章我們已經(jīng)在小鼠模型上用基于GC-MS的代謝組學方法揭示了Tat可誘導體內(nèi)多種代謝物發(fā)生變化，為了深入研究其干擾機制，本章我們在體外以HIV-1Tat處理的Jurkat T淋巴細胞為研究對象，采用基于GC-MS、RPLC-MS和HILIC-MS相結(jié)合的代謝組學方法檢測Tat處理的Jurkat T淋巴細胞胞內(nèi)及胞外代謝物，并用PCA和PLS-DA對所獲得的代謝組數(shù)據(jù)進行模式識別。通過信息處理得到了37種差異代謝物，根據(jù)標志物，我們構(gòu)建了Tat調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)示意圖，并采用實時定量PCR的方法對代謝通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶進行了測定，得到了7種顯著改變的調(diào)節(jié)酶且與代謝物變化相符，從酶的調(diào)控驗證了Tat誘導的代謝變化。本研究結(jié)合上章的結(jié)果提示Tat可能是HIV相關(guān)的代謝綜合癥的重要致病因子。我們的研究結(jié)果為Tat藥物靶點的發(fā)現(xiàn)和疫苗的設(shè)計提供科學依據(jù)。 四、我國HIV感染者中抗Tat抗體的反應(yīng)特點研究 在HIV-1感染者中，Tat抗體的出現(xiàn)與艾滋病的發(fā)病及病呈進展的關(guān)系出現(xiàn)了兩種相反的結(jié)論。因此，全面深入的Tat抗體檢測有助于揭示Tat和HIV發(fā)病及病程的關(guān)系，對Tat的致病性研究及開發(fā)有效的Tat疫苗具有重要意義。為了鑒定Tat抗體反應(yīng)類型，我們測定了326份HIV感染者中抗Tat抗體反應(yīng)，，100份健康獻血員血漿作為陰性對照。我們首先用全長Tat作為檢測抗原從326份HIV陽性血漿樣本中篩選抗Tat抗體陽性樣本，進一步用我們設(shè)計合成的6個Tat肽段作為分析抗原將抗體反應(yīng)進行分類，并對每個樣本的Tat反式激活的中和能力進行評價。結(jié)果顯示，326份HIV陽性血漿樣本檢測出42份為抗Tat抗體陽性和6份Tat相關(guān)抗體，根據(jù)與不同分析抗原的反應(yīng)特點將其分為以下6種反應(yīng)類型：全陽性反應(yīng)、綜合的反應(yīng)、N-特異性反應(yīng)、C-特異性反應(yīng)、全長Tat反應(yīng)和Tat相關(guān)反應(yīng)。中和實驗顯示Tat反式激活的中和能力與抗體反應(yīng)類型及CD8+T細胞計數(shù)顯著相關(guān)。我們的結(jié)果為更好地理解Tat在HIV致病中的重要作用和設(shè)計有效的Tat疫苗提供重要信息，也為進一步用代謝組學方法研究Tat在HIV感染者體內(nèi)的生物活性奠定基礎(chǔ)。 本文是首次通過基于LC-MS和GC-MS相結(jié)合的代謝組學方法在整體動物和細胞水平對Tat活性進行系統(tǒng)的代謝組學研究，通過多變量數(shù)據(jù)分析得到了Tat活性相關(guān)的差異代謝物，涉及糖酵解、三羧酸循環(huán)、脂代謝和氨基酸代謝等多條代謝通路。這些發(fā)現(xiàn)有助于揭示Tat“病毒毒素”復雜的致病機制，提示Tat可能作為治療性干預的重要靶標，阻斷或修飾這些異常的代謝通路對于治療由HIV感染引起的代謝紊亂綜合癥具有潛在的應(yīng)用價值。此外，我們的結(jié)果表明基于整合的GC-MS和LC-MS的代謝組學方法在細胞代謝物組分析中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R346

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本文編號：2309128