【摘要】：目的： 利用肺炎衣原體(Chlamdia pneumoniae, C.pn)體外感染大鼠血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)模型,分析C.pn感染對(duì)VSMC(?)細(xì)胞遷移相關(guān)基因表達(dá)的影響：觀察C.pn感染對(duì)VSMC粘附和遷移能力的影響；探討IQGAP1在C.pn感染誘導(dǎo)VSMC粘附和遷移中的作用。 方法： 1.C.pn增殖培養(yǎng)后體外感染大鼠VSMC; 2.應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析C.pn感染大鼠VSMC12h后,VSMC內(nèi)細(xì)胞遷移相關(guān)基因表達(dá)的改變； 3.運(yùn)用MTT去觀察C.pn感染對(duì)VSMC粘附能力的影響； 4.應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察C.pn感染對(duì)VSMC遷移能力的影響； 5.利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)C.pn感染的VSMC內(nèi)IQGAP1mRNA的表達(dá)水平； 6.采用Western blot技術(shù)檢測(cè)C.pn感染的VSMC為IQGAP1蛋白的表達(dá)水平； 7.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)使IQGAP1表達(dá)水平下調(diào),RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IQGAP1mRNA的表達(dá),以確定干擾效果； 8.運(yùn)用MTT法觀察RNA干擾下調(diào)IQGAP1基因后對(duì)C.pn感染誘導(dǎo)的VSMC粘附的影響； 9.應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察RNA干擾沉默IQGAP1表達(dá)后對(duì)C.pn感染誘導(dǎo)的VSMC遷移的影響。 結(jié)果： 1.C.pn感染組與正常對(duì)照組均應(yīng)用Affymetrix Rat Genome2302.0Array,通過(guò)與大鼠31000個(gè)探針進(jìn)行雜交,分析了31042個(gè)轉(zhuǎn)錄體和變異體,其中包括28000個(gè)己知基因。芯片雜交結(jié)果通過(guò)計(jì)算機(jī)掃描、定量和分析后,共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因35個(gè),其中上調(diào)基因12個(gè),下調(diào)基因23個(gè)；與細(xì)胞遷移密切相關(guān)的TLR2基因上調(diào)、TGF-B3和AKAP12基因下調(diào)�；虮倔w論分析結(jié)果顯示,35個(gè)差異顯著的基因中,30個(gè)基因可以在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能中找到注釋,4個(gè)基因未搜索到其功能分類；代謝通路分析結(jié)果顯示,7個(gè)基因參與細(xì)胞周期相關(guān)的信號(hào)通路、補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑相關(guān)信號(hào)通路、氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路和前列腺素合成調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路； 2.C.pn感染VSMC16h后,細(xì)胞粘附于Matrigel的能力明顯增強(qiáng)。MTT比色結(jié)果顯示,C.pn感染組的吸光度(Absorbance, A)值明顯高于正常對(duì)照組(P0.001)；Cpn感染組的細(xì)胞粘附率為162.342%±4.691%(P0.001)； 3.C.pn感染VSMC19h后,C.pn感染組的細(xì)胞遷移數(shù)目明顯多于正常對(duì)照組(P0.01)；細(xì)胞遷移指數(shù)為152.653%±7.493%(P0.01)； 4.C.pn感染VSMC2h后,IQGAP1(?)帶亮度與正常對(duì)照組差別不大；隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),IQGAP1條帶亮度逐漸增強(qiáng)；C.pn感染12h時(shí)IQGAP1條帶亮度最強(qiáng)；之后,IQGAP1條帶亮度又逐漸減弱,直至感染48h時(shí),條帶亮度與正常對(duì)照組基本相同； 5. Western blot結(jié)果顯示,C.pn感染VSMC后,隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),IQGAP1的表達(dá)水平也整體表現(xiàn)出先逐漸升高而后又逐漸降低的趨勢(shì)；C.pn感染VSMC16h時(shí)IQGAP1的表達(dá)水平最高；隨后,IQGAP1的表達(dá)水平又逐漸降低； 6.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VSMC后24h,熒光顯微鏡下可觀察到pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1Scrambled shRNA轉(zhuǎn)染組(陰性對(duì)照組)和pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均發(fā)出清晰的綠色熒光,而無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組和正常對(duì)照組細(xì)胞中則未見(jiàn)有綠色熒光；轉(zhuǎn)染48h后,各組細(xì)胞中的綠色熒光較24h時(shí)增強(qiáng)；RT-PCR結(jié)果顯示,無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)IQGAP1mRNA表達(dá)水平與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異；而IQGAP1mRNA在pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNA轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯降低： 7.經(jīng)MTT比色后發(fā)現(xiàn),pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs轉(zhuǎn)染組的A值明顯低于對(duì)照組(P0.001),細(xì)胞粘附率為68.543%±1.197%(P0.001)；陰性對(duì)照組細(xì)胞粘附于Matrigel的能力與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯變化(P0.05)；C.pn感染轉(zhuǎn)染pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs的VSMC后,該組的A值明顯低于C.pn感染組(P0.001),其細(xì)胞粘附率為104.991%±1.225%(P0.001)； 8.重組質(zhì)粒pGPHl/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs轉(zhuǎn)染VSMC后,細(xì)胞遷移數(shù)目明顯低于正常對(duì)照組(P0.01),細(xì)胞遷移指數(shù)為69.927%±4.838%(P0.01)；陰性對(duì)照組細(xì)胞的遷移數(shù)目與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(P0.05)；C.pn感染轉(zhuǎn)染pGPH1/GFP/Neo-IQGAP1shRNAs的VSMC后,該組細(xì)胞遷移數(shù)目明顯低于C.pn感染組(P0.01),細(xì)胞遷移指數(shù)為109.553%±4.401%(P0.01)。 結(jié)論： C.pn感染有可能通過(guò)上調(diào)TLR2基因并下調(diào)TGF-β3和AKAP12基因,促使VSMC遷移,進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展；C.pn感染可促進(jìn)VSMC粘附和遷移,其機(jī)制可能與其上調(diào)IQGAP1的表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)控某些細(xì)胞遷移相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2308350