【摘要】：目的:研究種去泛素化酶──泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)對大鼠血管平滑肌細胞(VSMC)遷移的生物學作用,探索UCH-L1通過影響核轉錄因子(NF-κB)活性調控VSMC遷移的分子機制,為深刻認識動脈粥樣硬化等血管疾病的病理生理學機理提供新的科學依據(jù)。 方法:采用組織塊貼壁法體外培養(yǎng)健康雄性Wistar大鼠的胸主動脈血管平滑肌細胞,用-平滑肌肌動蛋白( -actin)抗體對細胞進行免疫熒光鑒定;以腫瘤壞死因子-(TNF- )誘導VSMC的遷移,采用改良的Boyden小室方法和劃痕法(Wound Scratch Assay)檢測細胞遷移能力。觀察不同濃度的TNF-對VSMC遷移的誘導效應及不同作用時間下細胞遷移變化,探索TNF-誘導VSMC遷移效率較高時最佳的細胞培養(yǎng)密度和作用時間;用Westen Blot法檢測UCH-L1在TNF-誘導VSMC遷移過程中蛋白表達水平的變化,研究UCH-L1表達水平與TNF-誘導VSMC遷移過程的相關性規(guī)律。分別構建UCH-L1高表達和UCH-L1 RNA干擾表達的腺病毒載體以調節(jié)VSMC中UCH-L1的表達水平,觀察細胞內UCH-L1水平對生理狀態(tài)及TNF-誘導狀態(tài)下VSMC遷移能力的影響。UCH-L1高表達的VSMC經TNF-處理不同時間后,用Westen Blot法檢測NF-κB的兩種抑制蛋白IκB和IκB?的蛋白水平變化,觀察UCH-L1對IκB和IκB?蛋白降解過程的影響。采用脂質體轉染方式分別將UCH-L1表達載體質粒、IκB或IκB?表達載體質粒與NF-κB熒光素酶報告基因質粒共轉染大鼠大動脈平滑肌細胞系(A7r5細胞),用TNF-處理細胞6h以激活細胞內NF-κB的轉錄,用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶的相對活性,觀察UCH-L1與IκB或IκB?的表達分別或同時升高對NF-κB轉錄活性水平的影響,研究IκB和IκB?在UCH-L1調節(jié)NF-κB活性過程中的作用,并進步用免疫共沉淀的方法驗證UCH-L1分別與IκB和IκB?蛋白間的相互作用。 結果: TNF-對VSMC遷移的誘導作用具有明確的劑量和時間依賴關系。當TNF-誘導濃度為10ng/ml時,VSMC遷移效率最高;且隨著TNF-誘導時間延長VSMC遷移逐漸增加。細胞劃痕實驗中,TNF-誘導12h時劃痕間距顯著變小(P0.05),至48h時劃痕間距幾近消失,細胞遷移至完全融合狀態(tài)。TNF-誘導VSMC遷移過程中,細胞內UCH-L1蛋白表達水平在TNF-誘導12h后顯著升高(P0.05),并隨誘導時間延長呈逐漸升高的趨勢,且在誘導36h時達到最高峰。腺病毒載體感染VSMC后,發(fā)現(xiàn)UCH-L1表達升高可以明顯抑制生理狀態(tài)和TNF-誘導狀態(tài)下的VSMC遷移能力,而UCH- L1表達降低使VSMC遷移能力明顯增強。進步觀察TNF-作用下VSMC內IκB和IκB?蛋白水平,可見其隨誘導時間延長逐步下降,而UCH-L1高表達可顯著抑制IκB和IκB?水平的下降,提示IκB和IκB?是UCH-L1介導的NF-κB活性抑制中的主要作用靶點。分別將UCH-L1表達載體、IκB或IκB?表達載體與NF-κB報告基因載體共轉染A7r5細胞后,發(fā)現(xiàn)UCH-L1表達升高能明顯抑制生理狀態(tài)和TNF-誘導狀態(tài)下NF-κB轉錄因子活性;UCH-L1與IκB同時高表達對NF-κB活性抑制效應產生協(xié)同作用而更強,與IκB?同時高表達時UCH-L1對NF-κB活性的抑制效應影響不明顯。免疫共沉淀實驗確認了UCH- L1與IκB?之間存在相互作用,與與IκB之間未發(fā)現(xiàn)相互作用。 結論: UCH-L1抑制TNF-誘導的VSMC遷移,其通過減緩細胞中IκB和IκB?的降解,維持細胞內IκB和IκB?對NF-κB活性的負調控,實現(xiàn)了對VSMC遷移的TNF- /IκB和IκB?/NF-κB信號調控通路的阻抑。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2307905