【摘要】：目的:研究種去泛素化酶──泛素C末端水解酶L1(UCH-L1)對大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)遷移的生物學(xué)作用,探索UCH-L1通過影響核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活性調(diào)控VSMC遷移的分子機(jī)制,為深刻認(rèn)識動脈粥樣硬化等血管疾病的病理生理學(xué)機(jī)理提供新的科學(xué)依據(jù)。 方法:采用組織塊貼壁法體外培養(yǎng)健康雄性Wistar大鼠的胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞,用-平滑肌肌動蛋白( -actin)抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定;以腫瘤壞死因子-(TNF- )誘導(dǎo)VSMC的遷移,采用改良的Boyden小室方法和劃痕法(Wound Scratch Assay)檢測細(xì)胞遷移能力。觀察不同濃度的TNF-對VSMC遷移的誘導(dǎo)效應(yīng)及不同作用時(shí)間下細(xì)胞遷移變化,探索TNF-誘導(dǎo)VSMC遷移效率較高時(shí)最佳的細(xì)胞培養(yǎng)密度和作用時(shí)間;用Westen Blot法檢測UCH-L1在TNF-誘導(dǎo)VSMC遷移過程中蛋白表達(dá)水平的變化,研究UCH-L1表達(dá)水平與TNF-誘導(dǎo)VSMC遷移過程的相關(guān)性規(guī)律。分別構(gòu)建UCH-L1高表達(dá)和UCH-L1 RNA干擾表達(dá)的腺病毒載體以調(diào)節(jié)VSMC中UCH-L1的表達(dá)水平,觀察細(xì)胞內(nèi)UCH-L1水平對生理狀態(tài)及TNF-誘導(dǎo)狀態(tài)下VSMC遷移能力的影響。UCH-L1高表達(dá)的VSMC經(jīng)TNF-處理不同時(shí)間后,用Westen Blot法檢測NF-κB的兩種抑制蛋白IκB和IκB?的蛋白水平變化,觀察UCH-L1對IκB和IκB?蛋白降解過程的影響。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式分別將UCH-L1表達(dá)載體質(zhì)粒、IκB或IκB?表達(dá)載體質(zhì)粒與NF-κB熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染大鼠大動脈平滑肌細(xì)胞系(A7r5細(xì)胞),用TNF-處理細(xì)胞6h以激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB的轉(zhuǎn)錄,用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶的相對活性,觀察UCH-L1與IκB或IκB?的表達(dá)分別或同時(shí)升高對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性水平的影響,研究IκB和IκB?在UCH-L1調(diào)節(jié)NF-κB活性過程中的作用,并進(jìn)步用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證UCH-L1分別與IκB和IκB?蛋白間的相互作用。 結(jié)果: TNF-對VSMC遷移的誘導(dǎo)作用具有明確的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。當(dāng)TNF-誘導(dǎo)濃度為10ng/ml時(shí),VSMC遷移效率最高;且隨著TNF-誘導(dǎo)時(shí)間延長VSMC遷移逐漸增加。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,TNF-誘導(dǎo)12h時(shí)劃痕間距顯著變小(P0.05),至48h時(shí)劃痕間距幾近消失,細(xì)胞遷移至完全融合狀態(tài)。TNF-誘導(dǎo)VSMC遷移過程中,細(xì)胞內(nèi)UCH-L1蛋白表達(dá)水平在TNF-誘導(dǎo)12h后顯著升高(P0.05),并隨誘導(dǎo)時(shí)間延長呈逐漸升高的趨勢,且在誘導(dǎo)36h時(shí)達(dá)到最高峰。腺病毒載體感染VSMC后,發(fā)現(xiàn)UCH-L1表達(dá)升高可以明顯抑制生理狀態(tài)和TNF-誘導(dǎo)狀態(tài)下的VSMC遷移能力,而UCH- L1表達(dá)降低使VSMC遷移能力明顯增強(qiáng)。進(jìn)步觀察TNF-作用下VSMC內(nèi)IκB和IκB?蛋白水平,可見其隨誘導(dǎo)時(shí)間延長逐步下降,而UCH-L1高表達(dá)可顯著抑制IκB和IκB?水平的下降,提示IκB和IκB?是UCH-L1介導(dǎo)的NF-κB活性抑制中的主要作用靶點(diǎn)。分別將UCH-L1表達(dá)載體、IκB或IκB?表達(dá)載體與NF-κB報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染A7r5細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)UCH-L1表達(dá)升高能明顯抑制生理狀態(tài)和TNF-誘導(dǎo)狀態(tài)下NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性;UCH-L1與IκB同時(shí)高表達(dá)對NF-κB活性抑制效應(yīng)產(chǎn)生協(xié)同作用而更強(qiáng),與IκB?同時(shí)高表達(dá)時(shí)UCH-L1對NF-κB活性的抑制效應(yīng)影響不明顯。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了UCH- L1與IκB?之間存在相互作用,與與IκB之間未發(fā)現(xiàn)相互作用。 結(jié)論: UCH-L1抑制TNF-誘導(dǎo)的VSMC遷移,其通過減緩細(xì)胞中IκB和IκB?的降解,維持細(xì)胞內(nèi)IκB和IκB?對NF-κB活性的負(fù)調(diào)控,實(shí)現(xiàn)了對VSMC遷移的TNF- /IκB和IκB?/NF-κB信號調(diào)控通路的阻抑。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2307905