發(fā)布時(shí)間：2018-10-29 10:33

【摘要】：[背景]情感和學(xué)習(xí)記憶是認(rèn)知功能的核心,學(xué)習(xí)和記憶是所有認(rèn)知功能的基礎(chǔ)。海馬是與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的腦區(qū),其功能受到外部與其有著直接或間接纖維支配的神經(jīng)元及海馬內(nèi)部神經(jīng)環(huán)路的影響。研究表明,與情緒密切相關(guān)的腦區(qū)杏仁核有直接纖維投射至海馬并形成單突觸聯(lián)系,然而情緒對(duì)海馬依賴性空間情節(jié)學(xué)習(xí)記憶的影響及相關(guān)分子機(jī)制尚不清楚。海馬內(nèi)部神經(jīng)環(huán)路受到遺傳和表觀遺傳的影響。cAMP是調(diào)節(jié)細(xì)胞遺傳基因編碼和表觀遺傳因子表達(dá)的核心信使,除激活PKA外,cAMP還能直接激活鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換蛋白(EPAC, Exchange Protein Activated by Cyclic AMP)。在以學(xué)習(xí)記憶障礙為主要臨床表現(xiàn)的老年性癡呆患者腦內(nèi),EPAC基因表達(dá)異常。然而,EPAC信號(hào)傳導(dǎo)通路是否通過(guò)調(diào)控遺傳基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,從而介導(dǎo)海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的形成尚不清楚。[目的]在整體水平探討情緒學(xué)習(xí)或單純情緒應(yīng)激對(duì)海馬突觸形態(tài)和突觸傳遞可塑性及海馬依賴性空間情節(jié)記憶的影響及相關(guān)分子機(jī)制；探討EPAC偶聯(lián)的遺傳與表觀遺傳信號(hào)通路對(duì)海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控機(jī)制。[方法]在情緒影響海馬依賴性空間記憶及機(jī)制的研究中,我們采用電跳臺(tái)和單純電擊范式復(fù)制情緒學(xué)習(xí)和情緒應(yīng)激動(dòng)物模型,Morris水迷宮檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；采用免疫印跡檢測(cè)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平；采用免疫組化檢測(cè)杏仁核和海馬神經(jīng)元激活情況；采用腦片膜片鉗電生理學(xué)技術(shù)檢測(cè)海馬突觸傳遞可塑性；采用Golgi-cox染色和電鏡檢測(cè)海馬突觸形態(tài)可塑性；采用NMDA (N-methyl-D-aspartate)受體阻斷劑(D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid)抑制杏仁核基底外側(cè)核,明確基底外側(cè)核在情緒學(xué)習(xí)或單純情緒應(yīng)激影響海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶中的作用；采用基因沉默技術(shù)明確GluR2在情緒影響海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶中的作用。在EPAC偶聯(lián)的遺傳與表觀遺傳信號(hào)通路對(duì)海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶調(diào)控機(jī)制的研究中,我們選用EPAC1-/-、EPAC2-/-、EPAC1/2-/-和IN-EPAC小鼠,采用Morris水迷宮檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶能力；采用新鮮事物刺激,檢測(cè)社交能力；采用Golgi-cox染色和電鏡檢測(cè)海馬突觸結(jié)構(gòu)；采用免疫印跡檢測(cè)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平和Zif268蛋白水平；采用全細(xì)胞膜片鉗電生理學(xué)技術(shù)檢測(cè)海馬突觸傳遞可塑性；采用miRNA芯片檢測(cè)1miRNA變化；采用q-PCR檢測(cè)miR-124和Zif268水平；采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)研究miR-124和Zif268相互作用；構(gòu)建了鎖核苷酸修飾的反義寡核苷酸(LNA-miR-124)選擇性抑制腦內(nèi)miR-124的表達(dá)；構(gòu)建腺相關(guān)病毒載體表達(dá)miR-124；我們采用Rap1抗體進(jìn)行染色體免疫共沉淀檢測(cè)Rap1與miR-124相互作用。[結(jié)果]1.情緒相關(guān)學(xué)習(xí)通過(guò)杏仁核基底外側(cè)核易化海馬依賴性空間記憶,G1uR2參與情緒相關(guān)學(xué)習(xí)增強(qiáng)海馬突觸形態(tài)及其傳遞功能。為探討情緒對(duì)海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶的影響,我們采用電跳臺(tái)學(xué)習(xí)和單純電擊復(fù)制情緒依賴性學(xué)習(xí)和情緒應(yīng)激模型,結(jié)果顯示二者均能顯著激活杏仁核基底外側(cè)核(BLA)。與單純應(yīng)激組比,學(xué)習(xí)組能選擇性激活海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元,并增加海馬CA1和CA3區(qū)突觸相關(guān)蛋白GluR2的表達(dá)；Morris水迷宮檢測(cè)結(jié)果顯示,情緒相關(guān)學(xué)習(xí)能明顯易化海馬依賴性空間學(xué)習(xí)與記憶；腦片膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn),情緒相關(guān)學(xué)習(xí)能明顯易化海馬CA1區(qū)晚期LTP的形成。為進(jìn)一步明確杏仁核BLA在情緒學(xué)習(xí)易化海馬依賴性記憶功能中的作用,我們采用NMDA受體阻斷劑AP5抑制BLA再進(jìn)行電跳臺(tái)學(xué)習(xí)訓(xùn)練,然后檢測(cè)大鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果顯示,阻斷BLA時(shí)上述情緒相關(guān)學(xué)習(xí)對(duì)海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶的促進(jìn)作用幾乎消失；同樣,用基因沉默技術(shù)降低海馬CA1區(qū)GluR2水平時(shí),情緒相關(guān)學(xué)習(xí)對(duì)空間記憶準(zhǔn)確性的易化作用消失,而對(duì)學(xué)習(xí)過(guò)程無(wú)影響。2.EPAC失活突變通過(guò)增加miR-124轉(zhuǎn)錄,抑制Zif268翻譯損傷空間學(xué)習(xí)記憶和社交能力。為探討EPAC對(duì)海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶的影響,我們制備了EPAC1, EPAC2單基因以及EPAC1/EPAC2雙基因失活突變小鼠,并與野生型對(duì)照小鼠進(jìn)行對(duì)比研究。行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EPAC失活突變明顯損傷海馬依賴性空間學(xué)習(xí)記憶功能,同時(shí)電生理學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明EPAC失活突變減少突觸前谷氨酸釋放能力,損傷突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)。形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明EPAC失活突變不影響中樞神經(jīng)元發(fā)育及突觸結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果表明EPAC失活突變不影響突觸相關(guān)蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步探討EAPC失活突變損傷突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制,我們采用miRNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EPAC失活突變明顯增加miR-124水平。染色體免疫共沉淀結(jié)果結(jié)合藥物激活EPAC試驗(yàn)證實(shí)Rap1直接與miR-124基因的上游調(diào)控元件相互作用調(diào)控miR-124轉(zhuǎn)錄。采用LNA-miR-124選擇性抑制腦內(nèi)miR-124的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)EPAC失活突變的表型,過(guò)表達(dá)miR-124能模擬EPAC失活突變的各種表型。為尋找miR-124特異的靶mRNA,我們進(jìn)行了全基因組比較分析,結(jié)果顯示Zif268明顯下調(diào)。為明確miR-124對(duì)Zif268 mRNA的直接作用,我們突變Zif268并運(yùn)用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng),結(jié)果顯示miR-124可以直接結(jié)合Zif268mRNA并發(fā)揮抑制效應(yīng),同時(shí)過(guò)表達(dá)Zif268能有效逆轉(zhuǎn)miR-124增高的各種表型。此外,我們還發(fā)現(xiàn)EPAC失活突變損傷小鼠的社交能力。[結(jié)論]1.情緒相關(guān)學(xué)習(xí)通過(guò)杏仁核基底外側(cè)核促進(jìn)GluR2表達(dá),易化海馬突觸形態(tài)及海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶功能。2.EPAC失活突變通過(guò)增加miR-124轉(zhuǎn)錄,抑制Zif268翻譯損傷空間學(xué)習(xí)記憶和社交能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2297447