【摘要】：血吸蟲病(Schistosomiasis)是由血吸蟲(Schistosome)感染引起的一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病。全球有74個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行血吸蟲病,有5-6億人受到威脅,約2億人感染血吸蟲病。當(dāng)前血吸蟲的防治策略主要以化療藥吡喹酮來(lái)進(jìn)行治療,從而減少發(fā)病率。但是吡喹酮又不能避免重復(fù)感染,而且近年來(lái)曼氏血吸蟲已經(jīng)有吡喹酮抗性蟲株的報(bào)道,耐藥蟲株的出現(xiàn)引起了人們的不安與高度關(guān)注。因此,加強(qiáng)抗血吸蟲疫苗的開發(fā)和新藥物靶標(biāo)的篩選顯得格外重要。 在我國(guó),日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)可以感染40多種哺乳動(dòng)物,山羊、黃牛、綿羊、兔子和小鼠等都是其易感宿主,但是另外一些哺乳動(dòng)物如大鼠等是日本血吸蟲的不易感宿主。在不易感宿主體內(nèi),血吸蟲的發(fā)育率低而且蟲體較小。東方田鼠是目前為止唯一一種對(duì)日本血吸蟲具有抗性的宿主,日本血吸蟲尾蚴可以感染東方田鼠,感染之后蟲體發(fā)育遲緩,在感染尾蚴15天后,東方田鼠體內(nèi)基本上找不到存活的蟲體,感染42天后,東方田鼠體內(nèi)檢查不到日本血吸蟲成蟲。不同的宿主能夠?yàn)槿毡狙x提供不同的生存環(huán)境,影響到蟲體的生存和發(fā)育。不同宿主環(huán)境中生長(zhǎng)的蟲體在蛋白表達(dá)上也會(huì)存在差異,而這些差異表達(dá)的蛋白可能是蟲體生存發(fā)育所需要的關(guān)鍵分子。因此找到在不同易感性宿主環(huán)境中日本血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育差異的蛋白具有重要理論和實(shí)際意義。 1、日本血吸蟲童蟲在不同敏感性宿主體內(nèi)差異表達(dá)蛋白的研究 本文應(yīng)用熒光差異凝膠雙向電泳技術(shù)(2D-DIGE),對(duì)BALB/c小鼠、Wistar大鼠和東方田鼠體內(nèi)的10d日本血吸蟲童蟲的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了分析,通過(guò)DeCyder 6.5軟件分析和匹配后,得到了1721個(gè)點(diǎn)適合進(jìn)行后續(xù)的差異分析。在大鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白和小鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白的比較分析中發(fā)現(xiàn),有39個(gè)蛋白點(diǎn)存在顯著性差異,其中有27個(gè)蛋白點(diǎn)在小鼠體內(nèi)1Od童蟲中高表達(dá),12個(gè)蛋白點(diǎn)低表達(dá)。在小鼠體內(nèi)lOd童蟲蛋白和東方田鼠體內(nèi)10d童蟲蛋白的比較分析中發(fā)現(xiàn),有21個(gè)蛋白點(diǎn)存在顯著性差異,其中有13個(gè)蛋白點(diǎn)在小鼠體內(nèi)10d童蟲中高表達(dá),8個(gè)蛋白點(diǎn)低表達(dá)。 將分析膠與制備膠進(jìn)行比對(duì)挑點(diǎn),最終共有44個(gè)差異表達(dá)蛋白能夠進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜分析。將質(zhì)譜鑒定出的數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫(kù)比對(duì),其中3個(gè)蛋白點(diǎn)沒有注釋信息,其余41個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)過(guò)序列比對(duì)與去重復(fù)分析后發(fā)現(xiàn),共代表了33種蛋白。 為了驗(yàn)證2D-DIGE實(shí)驗(yàn)分析的可靠性,我們挑取了其中6個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量分析,在基因水平上對(duì)其結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果顯示,實(shí)時(shí)定量的結(jié)果與2D-DIGE的結(jié)果基本一致。 我們對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了GO分類以及KEGG通路分析,結(jié)果顯示,在小鼠體內(nèi)10d童蟲和大鼠體內(nèi)10d童蟲的差異表達(dá)蛋白中,40%的差異蛋白在蛋白代謝途徑中,26%的差異蛋白在糖類代謝途徑中,13%的差異蛋白在RNA代謝途徑中,9%的差異蛋白與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),其余的差異表達(dá)蛋白與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞骨架蛋白有關(guān)。在小鼠體內(nèi)10d童蟲和東方田鼠體內(nèi)10d童蟲的差異表達(dá)蛋白中,53%的差異蛋白在蛋白代謝途徑中,23%的差異蛋白在RNA代謝途徑中,其余的差異表達(dá)蛋白與糖類代謝途徑、核酸代謝途徑和細(xì)胞骨架蛋白有關(guān)。其中線粒體外膜轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物TOM34、蛋白酶體亞基、核內(nèi)核糖體異構(gòu)蛋白K和肌動(dòng)蛋白在易感宿主小鼠體內(nèi)高表達(dá),而半胱氨酸蛋白酶抑制劑、醛縮酶和70kDa熱激蛋白在不易感宿主大鼠體內(nèi)或抗性宿主東方田鼠體內(nèi)高表達(dá)。 本文首次對(duì)不同宿主體內(nèi)的日本血吸蟲10d童蟲進(jìn)行了蛋白質(zhì)組分析,為我們更好的理解血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供了依據(jù),同時(shí)也可為抗血吸蟲疫苗和潛在藥物靶標(biāo)的研究提供基礎(chǔ)。 2、日本血吸蟲蛋白酶體α5和α2亞基基因的克隆、表達(dá)及免疫效果觀察 本文利用RT-PCR技術(shù)從日本血吸蟲18d童蟲中首次擴(kuò)增到蛋白酶體a5亞基基因(GenBank accession FJ595238)。序列分析表明蛋白酶體α5亞基基因的ORF含747bp,編碼248個(gè)氨基酸,理論分子量27.38 kDa。同源性分析結(jié)果顯示,該基因分別為日本血吸蟲蛋白酶體α5亞基,命名為SjPSMA5。實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,該基因在7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d蟲體中都有表達(dá),13d和32d蟲體中的表達(dá)量高于其他時(shí)期；在小鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量要高于大鼠和東方田鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量。構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjPSMA5,在大腸桿菌系統(tǒng)中成功獲得了表達(dá),重組蛋白rSjPSMA5以包涵體形式存在。Western印跡顯示表達(dá)的重組蛋白rSjPSMA5能被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫血清所識(shí)別,并且能檢測(cè)到天然狀態(tài)下該蛋白的存在。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SjPSMA5蛋白在蟲體各組織器官內(nèi)廣泛分布。應(yīng)用重組蛋白免疫BALB/c小鼠后,產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平,并且CD4+細(xì)胞數(shù)量顯著升高,誘導(dǎo)了23.29%的減蟲率和35.23%的肝臟減卵率 本文利用RT-PCR技術(shù)從日本血吸蟲18d童蟲中擴(kuò)增到蛋白酶體α2亞基基因(GenBank accession AY813725)。序列分析表明蛋白酶體α2亞基基因的ORF含708bp,編碼235個(gè)氨基酸,理論分子量25.84 kDa。同源性分析結(jié)果顯示,該基因?yàn)槿毡狙x蛋白酶體α2亞基,命名為SjPSMA2。實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,該基因在7d、13d、18d、23d、32d和42d蟲體中都有表達(dá),7d和23d蟲體表達(dá)量低于其他幾個(gè)時(shí)期；在小鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量要略高于大鼠和東方田鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量。構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjPSMA2,在大腸桿菌系統(tǒng)中成功獲得了表達(dá),重組蛋白rSjPSMA2以包涵體形式存在。Western印跡顯示表達(dá)的重組蛋白rSjPSMA2能被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫血清所識(shí)別,并且能檢測(cè)到天然狀態(tài)下該蛋白的存在。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SjPSMA2蛋白在蟲體各組織器官內(nèi)廣泛分布。應(yīng)用該重組蛋白免疫BALB/c小鼠后,產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平,誘導(dǎo)了12.33%的減蟲率和35.23%的肝臟減卵率。 綜上所述,SjPSMA5和SjPSMA2都可作為潛在的抗血吸蟲病的疫苗候選分子,SjPSMA5和SjPSMA2基因及表達(dá)產(chǎn)物的獲得,為探索蛋白酶體在血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供了重要基礎(chǔ)。 3、日本血吸蟲硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶的特性研究 根據(jù)GenBank上公布的日本血吸蟲硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPx)基因的登陸號(hào)AY813893,對(duì)其序列進(jìn)行分析,結(jié)果表明,該基因的ORF含681bp,編碼227個(gè)氨基酸,理論分子量25.09 kDa。信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示,該基因的前24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。設(shè)計(jì)去除信號(hào)肽序列的引物,利用RT-PCR技術(shù)從日本血吸蟲42 d童蟲中擴(kuò)增到約600bp的產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果表明,擴(kuò)增片斷為日本血吸蟲硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶去除信號(hào)肽后的ORF序列。實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因在蟲體不同發(fā)育階段和不同宿主體內(nèi)10d童蟲中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,該基因在蟲卵、尾蚴、7d、13d、21d、28d、35d和42d蟲體中都有表達(dá),7d、13d和42 d雌蟲中表達(dá)量高于其他幾個(gè)時(shí)期；在大鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量要高于小鼠和東方田鼠體內(nèi)的10d童蟲中的表達(dá)量。構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjTPx,在大腸桿菌系統(tǒng)中成功獲得了表達(dá),重組蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在,Western印跡顯示表達(dá)產(chǎn)物能被日本血吸蟲成蟲粗抗原免疫血清所識(shí)別。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SjTPx蛋白主要分布于蟲體皮下實(shí)質(zhì)組織,體內(nèi)其他部分也有分布。質(zhì)譜鑒定的結(jié)果說(shuō)明,純化的重組SjTPx蛋白在體外可以以二聚體形式存在。酶活實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明,SjTPx在體外具有過(guò)氧化物酶活性。SjTPx基因及其表達(dá)產(chǎn)物的獲得,為探索硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶在血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的作用提供了重要基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2297068