【摘要】：研究背景 外界環(huán)境中許多天然或合成的物質(zhì)具有類雌激素樣結(jié)構(gòu)，可以產(chǎn)生擬內(nèi)源性雌激素樣效應(yīng)，故被稱為環(huán)境雌激素（Environmental Estrogens, EEs）。同時這些物質(zhì)也擾亂機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，故又被稱為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Environmental Endocrine Disruptors, EEDs）。塑料制品原料雙酚A(bisphenolA,BPA)是酚類環(huán)境雌激素的主要代表。以BPA單體形式聚合成的聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂等多種高分子材料是制造包括嬰兒奶瓶、水瓶、其他食品和飲料容器等的關(guān)鍵原料。BPA單體可在酸、堿或高溫環(huán)境下釋放出來。隨著工業(yè)化社會的發(fā)展，BPA的使用量越來越大。近年BPA的日常暴露劑量急速上升，目前人們每日接觸的BPA大約在1-2μg/kg水平（環(huán)境暴露劑量）。流行病學(xué)研究資料顯示，可在受檢對象血液、尿液、組織液中檢測到BPA。BPA對人類健康的影響受到研究者們的廣泛關(guān)注。新近國內(nèi)外一系列研究證實(shí)新生兒期或圍生期接觸環(huán)境劑量BPA能引起雄性動物發(fā)生雌化、性早熟和生殖缺陷。但是，有關(guān)青春前期接觸環(huán)境劑量BPA影響雄鼠性發(fā)育的研究卻非常少。 下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal, HPG)軸的激素對青春期性發(fā)育的啟動和成熟有重要的調(diào)控作用。下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神經(jīng)元的激活是HPG軸青春期啟動的關(guān)鍵。最近的研究表明，GnRH神經(jīng)元主要受到下丘腦弓狀核(arcuate nucleus,ARC)kisspeptin神經(jīng)元的直接調(diào)控。Kisspeptin與GnRH神經(jīng)元的G蛋白偶聯(lián)受體54(G protein-couple receptor54, GPR54)結(jié)合能調(diào)節(jié)GnRH的釋放。在青春前期，kisspeptin表達(dá)的快速增加，提示ARC核kisspeptin神經(jīng)元參與青春期的啟動。ARC-kisspeptin神經(jīng)元還同時表達(dá)神經(jīng)激肽B(neurokin B, NKB)、強(qiáng)啡肽(dynorphin, Dyn)，故又被稱為KNDy神經(jīng)元。同時，KNDy神經(jīng)元和GnRH神經(jīng)元都有NKB受體和Dyn受體的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，KNDy神經(jīng)元分泌的NKB和Dyn對KNDy神經(jīng)元和GnRH神經(jīng)元具有正向和負(fù)向的調(diào)控。此外，KNDy神經(jīng)元是GnRH/LH脈沖式釋放的起搏器，LH脈沖頻率增快被認(rèn)為是青春期啟動的重要標(biāo)志之一。KNDy神經(jīng)元表達(dá)雌激素受體(estrogen receptor, ER)α亞型，介導(dǎo)雌激素對KNDy神經(jīng)元的抑制性調(diào)節(jié)。但是，，有關(guān)BPA對KNDy神經(jīng)元、HPG軸青春期啟動和發(fā)育的影響迄今仍未見報道。 青春期睪丸的發(fā)育和成熟受到黃體生成素（luteinizing hormone, LH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)和睪酮(testosterone, T)的調(diào)節(jié)。青春前期激素水平的微小變動都有可能影響睪丸生精細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂的過程，引起睪丸發(fā)育和成熟的異常。早期的研究報道，環(huán)境雌激素BPA也可以直接改變睪丸激素的合成、分泌和代謝等。本課題將研究青春前期低劑量BPA暴露對雄鼠HPG軸發(fā)育和對睪丸發(fā)育的影響，并進(jìn)一步探討B(tài)PA影響睪丸發(fā)育的中樞神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制和外周靶細(xì)胞作用機(jī)制。 研究目的： 1.觀察青春前期低劑量BPA暴露對雄鼠HPG軸發(fā)育的影響及其機(jī)制。 2.探討青春前期低劑量BPA暴露對睪丸發(fā)育的影響及其分子機(jī)制。 第一部分研究青春前期低劑量BPA暴露對HPG軸發(fā)育的影響及其機(jī)制研究 材料與方法 1．動物模型制備：出生后(postnatal day, PND)21天的雄性SD大鼠給予連續(xù)14天低劑量BPA(2μg/kg/day)皮下注射（以下簡稱BPA大鼠）；雌激素（E2）（0.4μg/kg/day）皮下注射（以下簡稱E2大鼠），BPA(2μg/kg/day)+E2（0.4μg/kg/day）皮下注射。 2．激素水平檢測：用放射免疫法檢測血清的T、LH、FSH水平，LH脈沖釋放的頻率和幅度。 3．免疫組織染色：觀察ARC核kisspeptin免疫反應(yīng)陽性(kisspeptin+)細(xì)胞的數(shù)量，POA核GnRH免疫反應(yīng)陽性（GnRH+）細(xì)胞的數(shù)量。 4．實(shí)時定量PCR：檢測ARC核Kiss1、NKB和Dyn mRNA，POA核GnRH mRNA水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.與對照組相比，PND35-BPA大鼠T的水平降低，而LH和FSH水平顯著上升；PND35-E2大鼠的T、LH、FSH水平都明顯降低；PND55-BPA大鼠T的水平降低，LH和FSH水平無變化。 2.與對照組相比，PND35-BPA大鼠GnRH+細(xì)胞數(shù)量沒有改變，但是GnRHmRNA水平明顯增加；PND35-E2大鼠GnRH+細(xì)胞數(shù)量和GnRH mRNA水平都顯著降低。 3.與對照組相比，PND35-BPA大鼠kisspeptin+細(xì)胞數(shù)量，以及Kiss1、NKB和DynmRNA水平都明顯增加；PND35-E2大鼠kisspeptin+細(xì)胞數(shù)量顯著減少，Kiss1、NKB mRNA水平也相應(yīng)降低。BPA與E2聯(lián)合處理可以抑制E2大鼠的Kiss1、NKB mRNA水平降低。 4.與對照組相比，PND35-BPA大鼠的LH脈沖頻率加快，雖然脈沖幅度沒有改變；PND35-E2大鼠的LH脈沖頻率無明顯改變，但是脈沖幅度降低。 結(jié)論青春前期接觸低劑量BPA能增強(qiáng)青春期KNDy-GnRH表達(dá)，促進(jìn)LH和FSH的釋放，但是抑制睪酮的產(chǎn)生。 第二部分研究青春前期低劑量BPA暴露對睪丸發(fā)育的影響及其機(jī)制研究 材料與方法 1．睪丸組織學(xué)觀察：檢測PND35大鼠和PND55大鼠的體重、睪丸重量、睪丸臟器系數(shù)（睪丸重量/體重）、曲細(xì)精管直徑以及生精上皮厚度。檢測PND35大鼠睪丸變形期精子管腔率、I-VIII期管腔率、IX-XIV期管腔率、各級生精細(xì)胞數(shù)。檢測PND55大鼠附睪精子數(shù)、各級生精細(xì)胞數(shù)。 2.用TUNEL染色，檢測PND35和PND55大鼠的睪丸曲細(xì)精管凋亡細(xì)胞指數(shù)。 3．用實(shí)時定量PCR的方法，檢測PND35和PND55大鼠睪丸Fas、FasL和caspase3mRNA水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.與對照組相比，PND35-BPA大鼠體重增加，但是睪丸重量與睪丸臟器系數(shù)改變無顯著差異；PND55-BPA大鼠體重、睪丸重量、睪丸臟器系數(shù)都沒有明顯改變。 2.與對照組相比，PND35和PND55-BPA大鼠睪丸曲細(xì)精管直徑及生精上皮細(xì)胞層厚度均明顯減少。 3.與對照組相比，PND35-BPA大鼠變形精子管腔率下降，精原細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而精母細(xì)胞數(shù)量沒有改變。與對照組相比，PND55-BPA大鼠附睪精子數(shù)明顯下降，精母細(xì)胞及圓形精子細(xì)胞數(shù)量明顯減少。 4. PND35-BPA大鼠睪丸凋亡細(xì)胞顯著增多，PND55-BPA大鼠凋亡細(xì)胞與對照組相比無明顯改變。 5. PND35-BPA大鼠睪丸組織Fas、FasL和caspase-3的mRNA水平增加，而PND55-BPA大鼠Fas、FasL和caspase-3的mRNA水平無顯著改變。 結(jié)論 青春前期接觸低劑量BPA激活Fas-FasL信號通路，能增加生精細(xì)胞凋亡；持久性睪酮的缺乏，抑制精母細(xì)胞的減數(shù)分裂，導(dǎo)致睪丸發(fā)育和成熟的障礙。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R339.3

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本文編號：2283711