【摘要】：樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)是目前所知功能最強的、也是唯一能激活初始性T細胞(NT cell)的專職抗原提呈細胞(Antigen-presenting cell,APC),在免疫應答中處于中心地位。臨床和研究中的DCs通常是人外周血單核細胞(peripheral blood monouclear cell,PBMC)在細胞因子GM-CSF、IL-4作用下體外誘導一周得到。但是有研究人員提出這種細胞因子來源的DCs缺乏功能的完整性,而模擬DCs在體內的分化過程,在體外誘導DCs前體細胞向DCs的分化,對DCs功能的研究更具意義。 在體內短期循環(huán)的單核細胞在炎癥或損傷信號的刺激下,穿越血管內皮細胞進入外周組織到達炎癥位點,同時分化為DCs并進一步成熟�；趦绕ぜ毎峁┑奈h(huán)境在DC的發(fā)育中的重要作用,Randolph課題組最早提出了單核細胞-內皮細胞穿越模型,PBMCs通過兩次穿越原代人臍靜脈血內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分化為APCs,該細胞在功能和表型上都與DCs相似。但是該方法操作復雜,使得其應用受到極大的限制。而Schanen利用transwell技術將HUVECs與外周血單核細胞進行共培養(yǎng),在PBMCs單向穿越HUVECs細胞層后成功獲得DCs,培養(yǎng)過程不需要加入外源細胞因子,分化時間僅為兩天。但是以上培養(yǎng)系統(tǒng)存在著較大的缺點,即HUVECs是原代細胞,分離時操作繁瑣,在體外培養(yǎng)需要加入細胞因子,傳代次數(shù)較少,不適于長期使用。 本研究提出了構建分泌GM-CSF、IL-4的內皮細胞系EA.hy926來誘導PBMCs的分化。EA.hy926細胞是由HUVECs和人肺癌A549細胞融合得到,具有HUVEC的部分特征,可在不加入外源細胞因子的條件下在體外長期傳代,遺傳背景單一,避免了原代細胞培養(yǎng)的缺點。通過慢病毒重組系統(tǒng)將GM-CSF、IL-4的基因重組進入EA.hy926細胞的基因組中,達到提高兩個細胞因子表達的目的,該細胞系將對DC的分化培養(yǎng)具有重要的意義。 本論文成功構建了GM-CSF、IL4慢病毒共表達質粒;包裝獲得的重組慢病毒可以高效的感染內皮細胞系EA.hy926,感染后的EA.hy926經實時定量PCR、Western bloting及ELISA等多種方法進行蛋白翻譯表達的鑒定,經鑒定感染后細胞可以高效表達細胞因子GM-CSF、IL4,感染后細胞的生長狀態(tài)良好,能夠長期在體外進行傳代培養(yǎng),可以用于DC誘導實驗;絲裂霉素C(MMC)可以抑制細胞增殖,而不改變細胞分泌蛋白的性質,是體外常用的制備飼養(yǎng)層的方法之一,我們通過實驗,最終確定了MMC的作用時間和濃度。采用免疫磁珠的方法從人外周血單核細胞(PBMC)中分離得到了高純度的CD14+單核細胞,與建立的內皮細胞系進行共培養(yǎng),通過表型及形態(tài)分析,最后得出結論本實驗室建立的內皮細胞系可以誘導單核細胞分化為DCs,高表達T細胞共刺激分子和HLA-DR分子。本論文共分兩部分:(1)建立共表達GM-CSF、IL-4的EA.hy926內皮細胞系;(2)GM-CSF、IL-4-EA.hy926細胞作為飼養(yǎng)層與外周血單核細胞共培養(yǎng)。主要研究結果如下: 一、建立共表達GM-CSF、IL-4的EA.hy926內皮細胞系利用重疊PCR將GM-CSF、IL4基因通過剪切體T2A序列相連,得到GM-CSF-T2A-IL4融合基因。將融合基因構建入慢病毒表達載體pBPLV,得到重組的慢病毒表達載體。該重組慢病毒經雙酶切、測序鑒定顯示重組質粒構建成功。重組慢病毒載體及慢病毒包裝質粒、包膜質粒共轉染293FT細胞,轉染24h后經熒光顯微鏡觀察轉染效率達到90%以上;濃縮后的病毒可以有效的感染內皮細胞系EA.hy926細胞,感染后的細胞經過擴大培養(yǎng)后感染效率依然可以達到94%,說明目的基因可以在感染細胞內穩(wěn)定的傳代;感染后細胞進行生長曲線的測定,其結果說明,感染后細胞的生長趨勢沒有減弱,能夠很好的進行增殖;經實時定量PCR和ELISA方法證實感染后細胞hGM-CSF、hIL-4在mRNA水平的表達分別是未感染細胞的24倍和9946倍,在蛋白水平的表達分別是未感染細胞的145倍和23倍。 二、GM-CSF、IL-4-EA.hy926細胞作為飼養(yǎng)層與外周血單核細胞共培養(yǎng)在絲裂霉素C(MMC)抑制內皮細胞系生長的實驗中,確定了在處理時間為2.5h時,MMC的濃度選擇為10μg/ml。在此濃度作用下,內皮細胞系生長受到抑制,但是保持其分泌的功能;利用磁珠分選CD14+單核細胞分選純度達到94%以上,與以構建的內皮細胞系進行共培養(yǎng)后, CD14+單核細胞向DC方向分化,分化得到的DC表面有細小而密集的突起,流式細胞術檢測DC表面的標志,結果顯示此方法得到的DC表達CD1a,CD83,高表達DC特異性表面標志DC-SIGN,高表達共刺激分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

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本文編號：2281432