【摘要】：胚胎干細胞是來源于早期胚胎內(nèi)細胞團(Inner cell mass,ICM)或桑椹胚的一種多潛能細胞[1]，能在體外自我更新，在適當?shù)臈l件下可以分化為成體的各種類型的組織細胞[2]，是當前生物學研究的熱點，在發(fā)育生物學、遺傳學、毒理學和藥物篩選研究等領域中發(fā)揮著日益重要的作用[3]。2007年底，日本和美國兩個科研小組應用病毒將Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4[4]（或者是Nanog和Lin28[5]）四個基因轉導至人的成纖維細胞，使其逆向分化為具有胚胎干細胞特性的多潛能干細胞，即為誘導的多潛能干細胞（iPSCs細胞，induced pluripotent stemcells）[6-8]。iPSCs細胞具有和胚胎干細胞類似的生物學特性，通過這個技術建立病人特異的胚胎干細胞系，可以徹底的解決細胞治療中的免疫排斥問題，而且繞開了胚胎干細胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙，為疾病發(fā)生發(fā)展的機理研究、疾病特異性藥物的篩選和細胞移植治療提供了很好的研究模型。胚胎干細胞以無限增殖能力和全能性等優(yōu)點，為組織工程種子細胞的重要潛在來源[5]。α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，αSMA)是細胞內(nèi)六種肌動蛋白亞類之一，在所有真核細胞中的表達都高度保守[6]。編碼它的基因是相對局限于在血管平滑肌細胞中表達的少數(shù)幾個基因之一，公認是血管平滑肌細胞表型轉化的標志[7]。 大量的實驗證明胚胎干細胞可以特異分化三胚層的細胞類型，為將來的細胞替代治療帶來了希望。然而，目前的胚胎干細胞分化研究都存在一個問題：難于純化目標細胞群。解決的方法主要有以下兩種，例如使用目的細胞特異抗體標記的方法，或者構建組織細胞特異啟動子攜帶報告基因的載體轉染細胞（分化以后所得到的目的細胞會帶有報告基因），最終都可以通過流式細胞分選技術收集目的細胞。后者較前者還具有優(yōu)勢，就是將攜帶報告基因的細胞移植到體內(nèi)后，能夠方便的觀察細胞在體內(nèi)的遷移、分化以及對移植效率進行有效的評估，為移植治療的研究提供了有力的工具，同時利用這種細胞可以進行體外的藥理、毒理和化學生物學等方面的研究。 轉基因就是將外源基因導入生物體或者細胞內(nèi)，使宿主的遺傳性狀發(fā)生改變。通過轉基因技術使干細胞攜帶標記基因，可以在體內(nèi)實驗中作為示蹤劑對移植的細胞進行跟蹤；體外實驗中，標記基因便于干細胞的觀察。鑒于胚胎干細胞和轉基因技術的重要性，因此，如何能將外源基因高效地轉入胚胎干細胞并能在不影響其生物學特性的情況下持續(xù)穩(wěn)定表達就顯得十分必要。目前，胚胎干細胞的轉基因方法有很多種[9]，包括物理方法（如電穿孔[10]）、化學方法（如Lipofectamine2000[11]）和病毒轉導[12]等三大類。由于胚胎干細胞呈克隆狀生長，生長環(huán)境比較復雜，通過傳統(tǒng)的轉基因方法很難獲得表達外源基因的均一性細胞群體，較理想的方法多是通過慢病毒載體介導而完成的。傳統(tǒng)的慢病毒質粒構建技術需要進行酶切、連接等過程，操作繁瑣復雜。近年來有科學家建立了一種更為靈活通用的克隆方法—Gateway技術，Gateway技術是利用λ噬菌體特異性結合位點，在Clonase的作用下整合到宿主E.coli的基因組中的一種新的通用型克隆技術[13]。利用Gateway技術構建慢病毒載體,只需要在目的基因兩端加上特異性的15bp大小的att結合位點,通過兩種Clonase作用下的BP和LR結合反應,即可將目的基因導入載體中,其整合率可達到100%。而且去除了酶切、連接過程,可以避免假陽性的出現(xiàn)。因其操作方便,Gateway技術近年來在基因工程中的應用已越來越廣泛[14]。 有鑒于此，本實驗的主要研究思路是，本研究先構建攜帶小鼠αSMA和αMHC基因啟動子的報告基因載體，然后以人誘導型多能干細胞為模型，經(jīng)誘導分化形成類胚體后，進一步添加報告基因載體，再特異性向平滑肌細胞分化，對所得到的熒光細胞進行鑒定和分析，并觀察向平滑肌細胞的分化。因此，本研究主要分為以下兩個部分： 第一部分：利用多位點Gateway技術構建系列慢病毒載體。 第二部分：攜帶組織特異啟動子的慢病毒載體轉導人誘導型多潛能細胞及其誘導分化的實驗研究。 第一部分利用多位點Gateway技術構建αSMA和αMHC基因啟動子慢病毒載體 1.1目的 利用Gateway技術構建αSMA和αMHC基因啟動子慢病毒載體，將載體質粒線性化后瞬時轉染C2C12細胞系，并且用免疫熒光染色檢測基因的表達。目的在于通過操作簡便的Gateway技術快速、高效的構建系列的慢病毒載體。 1.2方法 1.2.1利用Gateway技術中涉及到的LR結合反應，將入門克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP和PDONRTML4-EF1-α-R1與目的載體2K7puro進行連接，構建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質粒。 1.2.2通過LR反應將pUp-αSMA和pDown-hrGFP(含att位點的hrGFP入門克隆)連接到目的載體pDEST-puromycin，得到pLVpuro/α-SMA-hrGFP的表達載體；經(jīng)PCR和測序鑒定，將載體質粒瞬時轉染C2C12細胞系，并且用免疫熒光染色檢測基因的表達。 1.3結果 1.3.1將攜帶報告基因的入門克隆pDONRTM221-reporter gene和攜帶啟動子的pDONRTML4-promoter-R1與目的載體2K7puro進行連接，成功構建pLVpuro/αSMA-hrGFP gene和pLVpuro/αMHC-hrGFP gene的表達載體，測序結果表明啟動子序列正確，將表達載體轉化入大腸桿菌后，得到單細菌克隆。 1.3.2將pLVpuro/αSMA-hrGFP gene的表達載體質粒線性化后瞬時轉染C2C12細胞系，細胞48h至72h后，hrGFP報告基因和免疫熒光檢測證實C2C12細胞內(nèi)的熒光表達。 1.4結論 1.4.1成功構建αSMA以及αMHC基因啟動子的2K7puro/promoter-reporter gene的慢病毒表達載體。 1.4.2pLVpuro/αSMA-hrGFP gene和pLVpuro/αMHC-hrGFP gene的表達載體質粒線性化后瞬時轉染C2C12細胞系，細胞48h至72h后，證實構建的報告基因載體可以反映αSMA以及αMHC基因的表達情況。 第二部分：攜帶組織特異啟動子的慢病毒載體轉導人誘導型多潛能細胞及其誘導分化的實驗研究。 2.1目的 用攜帶特異啟動子的pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒載體轉導人iPSCs細胞，轉導后第7天開始使用嘌呤霉素篩選，即可獲得攜帶載體質粒的純化的人iPSCs細胞，然后加入誘導試劑促進人ES細胞向平滑肌分化，以獲得表達αSMA的綠色熒光細胞，并進行相關的鑒定分析。 2.2方法 2.2.1FSK-iPSCs細胞生物學特性的分析：對iPSCs細胞的分子標記及體內(nèi)外分化能力進行檢測。 2.2.2利用pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒載體轉導hrGFP進入iPSCs細胞 2.2.3抗生素篩選純化轉導后的FSK-iPSCs細胞 2.2.4轉導pLVpuro/αSMA-hrGFP的FSK-iPSCs細胞體外分化約5天后，通過流式細胞儀分選其CD4陽性細胞后繼續(xù)向血管平滑肌細胞定向誘導分化，并觀察其熒光表達情況。 2.3結果 2.3.1FSK-iPSCs細胞生物學特性：iPS細胞表達Oct4、SSEA-1，，在體內(nèi)外可以分化為三胚層的細胞類型。 2.3.2包裝pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒并轉染成功，抗生素篩選后得到陽性細胞克隆。 2.3.3轉導pLVpuro/αSMA-hrGFP的FSK-iPSCs體外分化后，通過流式細胞儀分選到CD4陽性細胞。 2.3.4分選到的CD4陽性細胞向血管平滑肌分化后，獲得表達αSMA的綠色熒光細胞。 2.4結論 2.4.1FSK-iPSCs細胞具有與人ES細胞相似的生物學特性 2.4.1成功利用pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒慢病毒轉導FSK-iPSCs細胞,轉導后定向分化為血管平滑肌并表達αSMA，證實構建的報告基因載體可以反映αSMA的表達情況，為以后分化機理和移植治療的研究提供了很好的工具。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中山大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 馬強;李明;董文其;吳英松;;一種新型慢病毒載體制備體系的初步建立[J];生物化學與生物物理進展;2007年08期

2 韓濤;郜金榮;吳正輝;李惠平;葉林柏;;艾滋病的基因治療策略及慢病毒載體[J];醫(yī)學分子生物學雜志;2007年03期

3 馬強;李明;董文其;吳英松;;一種新型慢病毒載體制備方法的建立[J];生物工程學報;2007年05期

4 王峰;陳琳;邵建國;;慢病毒綠色熒光蛋白感染人胰腺癌細胞株CFPAC-1的效率觀察[J];南通大學學報(醫(yī)學版);2008年01期

5 竇立萍;達萬明;王暢;康慧媛;趙瑜;孫敬芬;靳海杰;王全順;高春記;于力;;Kir2ds4基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[J];中國實驗血液學雜志;2008年03期

6 焦伊勝;王永來;張淑蘭;王桂玲;;凋亡蛋白抑制因子Livin shRNA慢病毒載體的構建與鑒定[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2008年24期

7 周磊;陳婕;徐欣;張敏;張新;;利用重組慢病毒載體建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白細胞系[J];中國臨床醫(yī)學;2009年02期

8 張樂;官國先;;SATB1基因RNAi慢病毒載體的構建與鑒定[J];中國實用醫(yī)藥;2009年14期

9 羅毅;王小聰;鄒萍;;Pir-b基因慢病毒載體的構建和表達[J];中國實驗血液學雜志;2009年04期

10 李軍;余松濤;司維柯;李招權;潘靜;趙宸;趙辰;;hTERT基因啟動子驅動eGFP的慢病毒載體構建及表達的初步研究[J];重慶醫(yī)學;2009年18期

相關會議論文 前10條

1 高書穎;于潔;;攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體的構建及鑒定[A];“細胞活動 生命活力”——中國細胞生物學學會全體會員代表大會暨第十二次學術大會論文摘要集[C];2011年

2 王海彬;;雌激素相關受體α基因超表達慢病毒載體的構建[A];中華醫(yī)學會第六次全國骨質疏松和骨礦鹽疾病學術會議暨中華醫(yī)學會骨質疏松和骨礦鹽疾病分會成立十周年論文匯編[C];2011年

3 蔡偉光;丁景華;習欠云;肖敏;江青艷;吳珍芳;張永亮;;慢病毒與精子孵育法介導轉基因豬的制備[A];全國動物生理生化第十一次學術交流會論文摘要匯編[C];2010年

4 于潔;高書穎;;攜帶hTERT基因的重組慢病毒載體的構建[A];中國的遺傳學研究——遺傳學進步推動中國西部經(jīng)濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2011年

5 徐敏;楊曉紅;陳龍;葉靜;李么明;陳煥春;曹勝波;;慢病毒載體介導表達西尼羅河病毒prME蛋白[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學分會第二次學術研討會論文集[C];2010年

6 劉峰;肖興鵬;田玉科;;大鼠蛋白激酶Cγ可控shRNA慢病毒的構建與鑒定[A];2011年全國醫(yī)藥學術論壇交流會暨臨床藥學與藥學服務研究進展培訓班論文集[C];2011年

7 宋喜;張克讓;;慢病毒介導的過表達GSK3β小鼠與抑郁障礙發(fā)生的研究[A];中華醫(yī)學會精神病學分會第九次全國學術會議論文集[C];2011年

8 劉競;余鋒;桂嶸;李昕;蔣鐵斌;王二華;李穎;王成紅;唐雪元;陳方平;;Survivin shRNA慢病毒載體構建[A];第13屆全國實驗血液學會議論文摘要[C];2011年

9 于福先;潘建治;朱志偉;陳曉宇;;豬白介素1 5(IL-1 5)基因克隆及其慢病毒載體的構建[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術研討會論文集（上冊）[C];2010年

10 薛美思;劉毅;;攜帶人胰島素基因慢病毒載體轉染臍帶間充質干細胞的實驗研究[A];中華醫(yī)學會整形外科學分會第十一次全國會議、中國人民解放軍整形外科學專業(yè)委員會學術交流會、中國中西醫(yī)結合學會醫(yī)學美容專業(yè)委員會全國會議論文集[C];2011年

相關重要報紙文章 前10條

1 銀萍;Gateway完成中國管理交接[N];國際商報;2009年

2 王沛霖;Gateway正式建立中國團隊[N];中國計算機報;2009年

3 楊宇良;AP Gateway的啟示[N];電腦報;2010年

4 本報記者 李智鵬;Gateway中國駛上快車道[N];計算機世界;2009年

5 本報記者 姜洋;Gateway LT系列首度登陸中國[N];中國計算機報;2008年

6 神州數(shù)碼網(wǎng)絡有限公司產(chǎn)品部副總經(jīng)理 李偉;Residential Gateway有效共享互聯(lián)網(wǎng)[N];中國計算機報;2001年

7 黃夢/編譯　;銷售模式有等改進 Gateway需重視渠道[N];電腦商報;2004年

8 本報記者 何京玉綜合報道;合并或者退出？[N];計算機世界;2004年

9 本報記者 黃智軍;Gateway 時尚品牌的本土化摸索[N];計算機世界;2009年

10 岐;Gateway兩款15.6英寸筆記本電腦上市[N];電腦商報;2009年

相關博士學位論文 前10條

1 韋燁;基因改造骨髓造血干細胞靶向抑制結直腸癌新生血管形成的實驗研究[D];復旦大學;2010年

2 俞曉嵐;過表達CXCR4的骨髓間質干細胞移植治療大鼠腦梗死的療效觀察[D];福建醫(yī)科大學;2010年

3 劉瑜;BTBD10在人腦膠質瘤中的表達及其對U251細胞株增殖和凋亡的影響[D];第二軍醫(yī)大學;2010年

4 林恒;線粒體轉錄因子A在重組人肝再生增強因子對梗阻性黃疸大鼠肝功能保護中的作用機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2009年

5 林文平;腦紅蛋白基因修飾的骨髓間充質干細胞對兔脊髓損傷保護作用的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2011年

6 王鵬;依賴p53的癌基因Wip1在人腦膠質瘤細胞惡性增殖機制中的作用研究[D];華中科技大學;2010年

7 呂學軍;Caveolin-1在LPS誘導AT-1細胞和小鼠肺部急性損傷中的作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2010年

8 蘇冠華;肝細胞生長因子基因修飾的骨髓間充質干細胞移植的促血管新生作用[D];華中科技大學;2010年

9 楊志峰;應用慢病毒載體介導RNA干擾在MCF-7細胞中剔降IKKα基因和制備轉基因小鼠模型的研究[D];第二軍醫(yī)大學;2006年

10 陳柏齡;慢病毒載體介導血管生成素-1基因修飾的骨髓間充質干細胞移植治療腦梗死的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學;2007年

相關碩士學位論文 前10條

1 馬貴亮;慢病毒載體介導的TNF-α基因在臍血間充質干細胞中的表達的實驗研究[D];青島大學;2010年

2 欒沖;可誘導表達hBMP-2基因的慢病毒載體的構建及其慢病毒的產(chǎn)生和鑒定[D];青島大學;2010年

3 陳豪;乙肝病毒X基因（HBVX）慢病毒載體的構建和鑒定[D];福建醫(yī)科大學;2011年

4 陳春;攜帶大鼠Foxp3基因慢病毒載體的構建及慢病毒包裝的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2011年

5 沈上杭;短發(fā)夾RNA抑制缺氧誘導因子-1α表達對腦膠質瘤細胞增殖、侵襲及轉移的影響[D];福建醫(yī)科大學;2010年

6 盛鵬程;綿羊Myostatin基因shRNA慢病毒載體的構建與鑒定[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2011年

7 魏衍全;慢病毒介導shRNA穩(wěn)定持續(xù)抑制口蹄疫病毒增殖的兩類細胞系的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2011年

8 劉偉;小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體的構建及鑒定[D];福建醫(yī)科大學;2011年

9 張曉宇;含LfcinB基因慢病毒載體的構建及體外對SKOV3細胞作用的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2011年

10 張國峰;慢病毒載體介導的RNAi抑制牛整聯(lián)蛋白亞基αv基因表達的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2011年

本文編號：2279850