【摘要】：胚胎干細(xì)胞是來源于早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass,ICM)或桑椹胚的一種多潛能細(xì)胞[1]，能在體外自我更新，在適當(dāng)?shù)臈l件下可以分化為成體的各種類型的組織細(xì)胞[2]，是當(dāng)前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，在發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)和藥物篩選研究等領(lǐng)域中發(fā)揮著日益重要的作用[3]。2007年底，日本和美國兩個(gè)科研小組應(yīng)用病毒將Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4[4]（或者是Nanog和Lin28[5]）四個(gè)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至人的成纖維細(xì)胞，使其逆向分化為具有胚胎干細(xì)胞特性的多潛能干細(xì)胞，即為誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞（iPSCs細(xì)胞，induced pluripotent stemcells）[6-8]。iPSCs細(xì)胞具有和胚胎干細(xì)胞類似的生物學(xué)特性，通過這個(gè)技術(shù)建立病人特異的胚胎干細(xì)胞系，可以徹底的解決細(xì)胞治療中的免疫排斥問題，而且繞開了胚胎干細(xì)胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙，為疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)理研究、疾病特異性藥物的篩選和細(xì)胞移植治療提供了很好的研究模型。胚胎干細(xì)胞以無限增殖能力和全能性等優(yōu)點(diǎn)，為組織工程種子細(xì)胞的重要潛在來源[5]。α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，αSMA)是細(xì)胞內(nèi)六種肌動(dòng)蛋白亞類之一，在所有真核細(xì)胞中的表達(dá)都高度保守[6]。編碼它的基因是相對局限于在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)的少數(shù)幾個(gè)基因之一，公認(rèn)是血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志[7]。 大量的實(shí)驗(yàn)證明胚胎干細(xì)胞可以特異分化三胚層的細(xì)胞類型，為將來的細(xì)胞替代治療帶來了希望。然而，目前的胚胎干細(xì)胞分化研究都存在一個(gè)問題：難于純化目標(biāo)細(xì)胞群。解決的方法主要有以下兩種，例如使用目的細(xì)胞特異抗體標(biāo)記的方法，或者構(gòu)建組織細(xì)胞特異啟動(dòng)子攜帶報(bào)告基因的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞（分化以后所得到的目的細(xì)胞會(huì)帶有報(bào)告基因），最終都可以通過流式細(xì)胞分選技術(shù)收集目的細(xì)胞。后者較前者還具有優(yōu)勢，就是將攜帶報(bào)告基因的細(xì)胞移植到體內(nèi)后，能夠方便的觀察細(xì)胞在體內(nèi)的遷移、分化以及對移植效率進(jìn)行有效的評估，為移植治療的研究提供了有力的工具，同時(shí)利用這種細(xì)胞可以進(jìn)行體外的藥理、毒理和化學(xué)生物學(xué)等方面的研究。 轉(zhuǎn)基因就是將外源基因?qū)肷矬w或者細(xì)胞內(nèi)，使宿主的遺傳性狀發(fā)生改變。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使干細(xì)胞攜帶標(biāo)記基因，可以在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中作為示蹤劑對移植的細(xì)胞進(jìn)行跟蹤；體外實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)記基因便于干細(xì)胞的觀察。鑒于胚胎干細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要性，因此，如何能將外源基因高效地轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞并能在不影響其生物學(xué)特性的情況下持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)就顯得十分必要。目前，胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因方法有很多種[9]，包括物理方法（如電穿孔[10]）、化學(xué)方法（如Lipofectamine2000[11]）和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]等三大類。由于胚胎干細(xì)胞呈克隆狀生長，生長環(huán)境比較復(fù)雜，通過傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因方法很難獲得表達(dá)外源基因的均一性細(xì)胞群體，較理想的方法多是通過慢病毒載體介導(dǎo)而完成的。傳統(tǒng)的慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)需要進(jìn)行酶切、連接等過程，操作繁瑣復(fù)雜。近年來有科學(xué)家建立了一種更為靈活通用的克隆方法—Gateway技術(shù)，Gateway技術(shù)是利用λ噬菌體特異性結(jié)合位點(diǎn)，在Clonase的作用下整合到宿主E.coli的基因組中的一種新的通用型克隆技術(shù)[13]。利用Gateway技術(shù)構(gòu)建慢病毒載體,只需要在目的基因兩端加上特異性的15bp大小的att結(jié)合位點(diǎn),通過兩種Clonase作用下的BP和LR結(jié)合反應(yīng),即可將目的基因?qū)胼d體中,其整合率可達(dá)到100%。而且去除了酶切、連接過程,可以避免假陽性的出現(xiàn)。因其操作方便,Gateway技術(shù)近年來在基因工程中的應(yīng)用已越來越廣泛[14]。 有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)的主要研究思路是，本研究先構(gòu)建攜帶小鼠αSMA和αMHC基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體，然后以人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞為模型，經(jīng)誘導(dǎo)分化形成類胚體后，進(jìn)一步添加報(bào)告基因載體，再特異性向平滑肌細(xì)胞分化，對所得到的熒光細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分析，并觀察向平滑肌細(xì)胞的分化。因此，本研究主要分為以下兩個(gè)部分： 第一部分：利用多位點(diǎn)Gateway技術(shù)構(gòu)建系列慢病毒載體。 第二部分：攜帶組織特異啟動(dòng)子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人誘導(dǎo)型多潛能細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究。 第一部分利用多位點(diǎn)Gateway技術(shù)構(gòu)建αSMA和αMHC基因啟動(dòng)子慢病毒載體 1.1目的 利用Gateway技術(shù)構(gòu)建αSMA和αMHC基因啟動(dòng)子慢病毒載體，將載體質(zhì)粒線性化后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系，并且用免疫熒光染色檢測基因的表達(dá)。目的在于通過操作簡便的Gateway技術(shù)快速、高效的構(gòu)建系列的慢病毒載體。 1.2方法 1.2.1利用Gateway技術(shù)中涉及到的LR結(jié)合反應(yīng)，將入門克隆PDONRTM221-dTomato/PDONRTM221-hrGFP和PDONRTML4-EF1-α-R1與目的載體2K7puro進(jìn)行連接，構(gòu)建2K7puro/EF1-α-dTomato和2K7puro/EF1-α-hrGFP載體質(zhì)粒。 1.2.2通過LR反應(yīng)將pUp-αSMA和pDown-hrGFP(含att位點(diǎn)的hrGFP入門克隆)連接到目的載體pDEST-puromycin，得到pLVpuro/α-SMA-hrGFP的表達(dá)載體；經(jīng)PCR和測序鑒定，將載體質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系，并且用免疫熒光染色檢測基因的表達(dá)。 1.3結(jié)果 1.3.1將攜帶報(bào)告基因的入門克隆pDONRTM221-reporter gene和攜帶啟動(dòng)子的pDONRTML4-promoter-R1與目的載體2K7puro進(jìn)行連接，成功構(gòu)建pLVpuro/αSMA-hrGFP gene和pLVpuro/αMHC-hrGFP gene的表達(dá)載體，測序結(jié)果表明啟動(dòng)子序列正確，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后，得到單細(xì)菌克隆。 1.3.2將pLVpuro/αSMA-hrGFP gene的表達(dá)載體質(zhì)粒線性化后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系，細(xì)胞48h至72h后，hrGFP報(bào)告基因和免疫熒光檢測證實(shí)C2C12細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)。 1.4結(jié)論 1.4.1成功構(gòu)建αSMA以及αMHC基因啟動(dòng)子的2K7puro/promoter-reporter gene的慢病毒表達(dá)載體。 1.4.2pLVpuro/αSMA-hrGFP gene和pLVpuro/αMHC-hrGFP gene的表達(dá)載體質(zhì)粒線性化后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞系，細(xì)胞48h至72h后，證實(shí)構(gòu)建的報(bào)告基因載體可以反映αSMA以及αMHC基因的表達(dá)情況。 第二部分：攜帶組織特異啟動(dòng)子的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人誘導(dǎo)型多潛能細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究。 2.1目的 用攜帶特異啟動(dòng)子的pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人iPSCs細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)后第7天開始使用嘌呤霉素篩選，即可獲得攜帶載體質(zhì)粒的純化的人iPSCs細(xì)胞，然后加入誘導(dǎo)試劑促進(jìn)人ES細(xì)胞向平滑肌分化，以獲得表達(dá)αSMA的綠色熒光細(xì)胞，并進(jìn)行相關(guān)的鑒定分析。 2.2方法 2.2.1FSK-iPSCs細(xì)胞生物學(xué)特性的分析：對iPSCs細(xì)胞的分子標(biāo)記及體內(nèi)外分化能力進(jìn)行檢測。 2.2.2利用pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)hrGFP進(jìn)入iPSCs細(xì)胞 2.2.3抗生素篩選純化轉(zhuǎn)導(dǎo)后的FSK-iPSCs細(xì)胞 2.2.4轉(zhuǎn)導(dǎo)pLVpuro/αSMA-hrGFP的FSK-iPSCs細(xì)胞體外分化約5天后，通過流式細(xì)胞儀分選其CD4陽性細(xì)胞后繼續(xù)向血管平滑肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，并觀察其熒光表達(dá)情況。 2.3結(jié)果 2.3.1FSK-iPSCs細(xì)胞生物學(xué)特性：iPS細(xì)胞表達(dá)Oct4、SSEA-1，，在體內(nèi)外可以分化為三胚層的細(xì)胞類型。 2.3.2包裝pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒并轉(zhuǎn)染成功，抗生素篩選后得到陽性細(xì)胞克隆。 2.3.3轉(zhuǎn)導(dǎo)pLVpuro/αSMA-hrGFP的FSK-iPSCs體外分化后，通過流式細(xì)胞儀分選到CD4陽性細(xì)胞。 2.3.4分選到的CD4陽性細(xì)胞向血管平滑肌分化后，獲得表達(dá)αSMA的綠色熒光細(xì)胞。 2.4結(jié)論 2.4.1FSK-iPSCs細(xì)胞具有與人ES細(xì)胞相似的生物學(xué)特性 2.4.1成功利用pLVpuro/αSMA-hrGFP慢病毒慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)FSK-iPSCs細(xì)胞,轉(zhuǎn)導(dǎo)后定向分化為血管平滑肌并表達(dá)αSMA，證實(shí)構(gòu)建的報(bào)告基因載體可以反映αSMA的表達(dá)情況，為以后分化機(jī)理和移植治療的研究提供了很好的工具。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2279850