【摘要】：目的 通過比較慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法對兔關(guān)節(jié)軟骨細胞生物學特性的影響,選擇較好的保存方法,為組織工程化關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)軟骨缺損的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法 2-4周齡新西蘭大白兔,無菌條件下取其關(guān)節(jié)軟骨細胞,進行體外的原代培養(yǎng)。分別用慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法將所取的兔關(guān)節(jié)軟骨細胞進行凍存,凍存時間為2周、1個月后取出部分凍存管,37℃水浴復(fù)溫后調(diào)定細胞濃度觀察,以新鮮軟骨細胞組作為對照組。對照組直接原代培養(yǎng)后檢測軟骨細胞生長活力及其生物學特性。慢速連續(xù)降溫法是將細胞懸液和凍存液的混合液,分別裝入凍存管,放入程控冰箱,以1℃/min的速度連續(xù)降溫至-80℃后,迅速放入液氮中保存的方法。慢速梯度降溫法是將細胞懸液和凍存液的混合液在降至-80℃之前,分4個梯度降溫的保存方法。玻璃化凍存法是將細胞懸液和玻璃化凍存液混合后,以最快的速度直接投入液氮中保存的方法。不同凍存方法的細胞于凍存2周、1個月時取出,行甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞表型、CCK8法繪制軟骨細胞生長曲線、Western blot方法檢測II型膠原表達,RT-PCR檢測II型膠原mRNA的表達情況。以新鮮軟骨細胞組作為對照組,比較各實驗組軟骨細胞的不同保存情況。 結(jié)果 1.軟骨細胞的形態(tài)觀察以及生長情況在顯微鏡下觀察:分離培養(yǎng)的原代軟骨細胞呈圓球形,呈懸浮狀態(tài),接種24h后大部分細胞開始沉降于培養(yǎng)瓶壁上,36h后貼壁率可達90%左右。貼壁后,細胞逐漸展開、變平、伸出短小的突出,外觀呈多角形、不規(guī)則形。細胞胞質(zhì)豐富,胞核清楚,核圓形或橢圓形,位于胞體中心,核仁為1-3個,具有折光性。約7d左右匯合成單層鋪滿整個培養(yǎng)皿底面。傳代后生長速度加快,約5d左右即可傳代,細胞周圍可見具有折光性的細胞外基質(zhì),細胞長成一片可呈明顯的“鋪路石”狀外觀。凍存2周復(fù)蘇后,慢速梯度降溫冷凍法的細胞生長形態(tài)較接近于新鮮軟骨細胞。慢速連續(xù)降溫組和玻璃化組,細胞呈長梭形或多角形,細胞數(shù)目少。凍存1個月時,實驗組細胞生長形態(tài)均較對照組有明顯區(qū)別,細胞胞質(zhì)減少,胞核不清晰。甲苯胺藍染色顯示,新鮮軟骨細胞經(jīng)細胞爬片后進行甲苯胺藍染色后鏡下觀察,軟骨細胞染成藍紫色,有核仁1-2個,對數(shù)生長期細胞明顯可見多數(shù)細胞有絲分裂相,細胞胞漿內(nèi)見藍紫色異染顆粒,細胞外基質(zhì)染成淺藍色,集落樣生長區(qū)中心濃染成紫紅色。隨著細胞傳代,染色逐漸變淺變淡。凍存2周、1個月時,各實驗組于胞漿中仍可見藍紫色異染顆粒,說明經(jīng)傳代以及凍存后,各組細胞仍保持軟骨細胞表型。 2.軟骨細胞活性的變化新鮮軟骨細胞組細胞生長曲線成對數(shù)型,保存2周、1個月時,各實驗組同對照組比較,細胞活性均較新鮮細胞組差。不同實驗組在凍存2周、1個月的時間點上,細胞生長活力凍存2周的生長情況要好于凍存1個月的細胞且差異明顯,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。凍存2周時,慢速梯度降溫冷凍法組的細胞生長情況明顯優(yōu)于慢速連續(xù)降溫法和玻璃化凍存法,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。凍存1個月時,慢速梯度降溫冷凍法組的細胞生長情況明顯優(yōu)于慢速連續(xù)降溫法和玻璃化凍存法,有統(tǒng)計學差異(P0.05)。不同凍存方法對軟骨細胞生長活力的影響不同且隨凍存時間的變化對軟骨細胞存活和率的影響也不同。隨凍存時間的延長,曲線的峰值出現(xiàn)的時間推后并且峰值降低。 3.軟骨細胞的生物學特性II型膠原表達凍存2周時,慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法的II型膠原表達均減少與新鮮軟骨細胞組比較有統(tǒng)計學差異(P0.05);慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法的II型膠原表達兩兩比較有統(tǒng)計學差異(P0.05)。凍存1個月時,慢速連續(xù)降溫法、慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法的II型膠原表達比較有統(tǒng)計學差異(P0.05)。在兩個時間點上,慢速梯度降溫法、玻璃化凍存法、慢速連續(xù)降溫法,凍存2周、1個月組內(nèi)兩兩比較有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 4.軟骨細胞II型膠原mRNA的表達四組的mRNA擴增產(chǎn)物中都能看到預(yù)期長度的II型膠原特異性條帶。新鮮軟骨細胞組II型膠原mRNA表達最強,與其它各組相比均有顯著差異。凍存2周時,三種的凍存方法中,慢速梯度降溫冷凍法組對II型膠原mRNA表達減少最弱,與慢速連續(xù)降溫法比較有顯著差異,與玻璃化凍存方法比較有顯著差異;慢速連續(xù)降溫法與玻璃化凍存方法比較無顯著差異。凍存1個月時,慢速梯度降溫冷凍法組的mRNA表達明顯高于慢速連續(xù)降溫法組和玻璃化凍存方法組,但低于慢速梯度降溫冷凍法組凍存2周時mRNA表達。 結(jié)論 1.慢速梯度降溫冷凍法對軟骨細胞活性及其生物學特性的影響較小,有一定的臨床應(yīng)用價值。 2.慢速梯度降溫冷凍法、玻璃化凍存法、慢速連續(xù)降溫冷凍法對關(guān)節(jié)軟骨細胞的影響均具有時間依從性,隨著時間的推移,軟骨細胞生物活性逐漸下降。 意義 雖然治療各種關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法非常多,但均不能達到理想的修復(fù)效果,不能恢復(fù)其原有的生物力學性能。組織工程化關(guān)節(jié)軟骨的構(gòu)建,為上述問題提供了更好的解決辦法。而構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨需要大量的種子細胞,同種異體軟骨細胞是種子細胞的一個重要來源但數(shù)量有限,且受到法律和倫理道德方面的約束,因此如何長期保存并大量應(yīng)用目前并沒有成熟的方法。本實驗通過比較目前常見的幾種凍存方法,篩選出較好的凍存方法保存種子細胞,為構(gòu)建組織工程化關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
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【學位授予單位】：泰山醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻】

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